Immunology and Infection
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ठीक सुई आकांक्षा द्वारा अतिरिक्त संवहनी Trypanosoma परजीवी की जांच
Chapters
Summary August 7th, 2019
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ठीक सुई आकांक्षा एक तकनीक है, जिससे कोशिकाओं को एक पतली सुई का उपयोग कर एक घाव या अंग से प्राप्त कर रहे हैं. Aspirated सामग्री गंदा, दाग और निदान के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत जांच की है या आणविक जीव विज्ञान, साइटोमेट्री या इन विट्रो विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया। यह सस्ता है, सरल, जल्दी और कम से कम आघात का कारण बनता है.
Transcript
ठीक सुई आकांक्षा साइटोलॉजी एक सस्ती, सरल, त्वरित और न्यूनतम आक्रामक तकनीक है जिसका उपयोग हम जीवित चूहों में अंगों में स्पष्ट घावों से ट्राइपानोसोम एकत्र करने के लिए करते हैं। यह देखते हुए कि ठीक सुई आकांक्षा एक गैर टर्मिनल प्रक्रिया है, यह समय के साथ एक ही जानवर में दोहराया नमूना के लिए अनुमति देता है । यदि इन निष्कर्षों का पशुओं में अनुवाद किया जा सकता है, तो यह विधि पशु चिकित्सकों के लिए एक खेत में मवेशियों में ट्राइपानोसोसोमियासिस का निदान करने के लिए बहुत उपयोगी होगी ।
धब्बा धुंधला प्रक्रिया का प्रदर्शन एना मार्गरिडा सैंटोस, मेरी प्रयोगशाला से एक सहायक प्रौद्योगिकीविद् होगा । शुरू करने के लिए, अंगुली चुटकी विधि के साथ एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। जब पैर के रिऐक्शन का पलटा अनुपस्थित होता है, तो माउस को पृष्ठीय प्रतिरूपता में स्थिति में रखें।
ओवरलिंग त्वचा से आकार और दूरी निर्धारित करने के लिए टेस्ट को सावधानीपूर्वक टटोलना और फिर इसे इंडेक्स और मिडिल फिंगर के बीच या इंडेक्स फिंगर और अंगूठे के बीच नियंत्रित करें। लक्ष्य को और स्थिर करने के लिए, ओवरलीइंग त्वचा को कसकर फैलाएं और शराब पोंछे के साथ सतह को साफ करें। इसके बाद, लक्ष्य में पांच मिलीलीटर सिरिंज से जुड़े 23 गेज सुई की सुई टिप डालें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्लंजर बाकी राज्य में है।
सक्शन लागू करने के लिए, सिरिंज प्लंजर को दो से तीन बार तीन से चार मिलीमीटर के निशान पर वापस लें। प्रतिनिधि नमूना प्राप्त करने और एपिडिडिमिस जैसी छोटी संरचनाओं को लक्षित करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, अंग के भीतर सुई को या तो एक सीधी रेखा में या कई अलग-अलग स्पर्शरेखाओं के साथ रीडायरेक्ट करें। सक्शन छोड़ें और फिर सुई वापस ले लें।
सुई केवल नकारात्मक दबाव दे प्लंजर के जाने से जारी किया जाता है के बाद हटाया जा सकता है । अन्यथा, एस्पिरेट सिरिंज में चूसा जाता है और अप्राप्य है। किसी भी रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए पंचर साइट पर एक बाँझ धुंध स्पंज के साथ दबाव लागू करें।
सिरिंज को सुई से डिस्कनेक्ट कर हवा से भर दें। सुई को फिर से कनेक्ट करें, सुई की नोक को बहुत करीब रखें या यहां तक कि स्लाइड पर भी रखें और धीरे-धीरे स्लाइड पर सुई की सामग्री को बाहर निकालें। नमूने को दोहराने के लिए, अंग और पशु प्रति कम से कम एक अतिरिक्त आकांक्षा प्रदर्शन करें।
खारा में प्रति किलोग्राम Atipamezole प्रति मिलीग्राम के २०० माइक्रोलीटर के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ संज्ञाहरण वापस करने के बाद, वसूली के लिए अपने घर पिंजरे में जानवरों को वापस । गैर-डोमिनेंट हाथ का उपयोग करके, उस स्लाइड को उठाएं जिसमें अंगूठे और इंडेक्स फिंगर के बीच पाले से ओढ़े हुए छोर को पिंचिंग करने वाले एस्पिरेट की बूंद है। प्रमुख हाथ का उपयोग करके, एक साफ स्प्रेडर स्लाइड उठाएं और इसे लगभग 30 डिग्री के कोण पर ड्रॉप के शीर्ष पर दूसरी स्लाइड में चिकनी साफ बढ़त रखें।
एक पतली फिल्म प्राप्त करने के लिए, एक प्रकाश सतत और स्थिर आंदोलन के साथ आगे स्लाइड फिसलना । स्लाइड आराम करें और सामग्री के पूर्ण और तेज हवा सुखाने के लिए अनुमति दें। एक पेंसिल के साथ स्लाइड के पाले से ओढ़ लिया किनारे लेबल।
गिम्सा धुंधला प्रोटोकॉल के लिए, पांच मिनट के लिए 100% मेथनॉल युक्त कोप्लिन जार में स्लाइड विसर्जित करके हवा सूखे स्मीयरों को ठीक करें। फिर स्लाइड को 20% गिम्सा समाधान और आसुत पानी वाले कोप्लिन जार में 30 मिनट के लिए स्थानांतरित करें। नल के पानी में स्लाइड कुल्ला और ऊतक कागज के साथ भिगोना अच्छी तरह से सूखने के लिए ।
स्लाइड को क्षैतिज रूप से पकड़े हुए, धब्बा पर nonaqueous बढ़ते माध्यम की कई बूंदों को लागू करें। स्लाइड पर एक कवर ग्लास के किनारे रखें, इसे कम करें और किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए धीरे-धीरे दबाएं। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 100% मेथनॉल में हवा सूखे स्मीयरों को ठीक करें।
हर बार ताजा 1X PBS का उपयोग करके इस कदम को तीन बार दोहराते हुए 1X पीबीएस के साथ एक कॉप्लिन जार में पांच मिनट के लिए स्लाइड धोएं। कोप्लिन जार से स्लाइड हटाने के बाद, धब्बा को छूने के बिना अतिरिक्त बफर पोंछ और एक पानी से बचाने वाली क्रीम कलम के साथ धब्बा के चारों ओर एक लाइन आकर्षित । स्लाइड को क्षैतिज रूप से पकड़े हुए, प्रत्येक धब्बा के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 150 माइक्रोलीटर लागू करें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, हर बार ताजा 1X PBS का उपयोग करके इस कदम को तीन बार दोहराते हुए 1X पीबीएस के साथ एक कॉपलिन जार में पांच मिनट के लिए स्लाइड धोएं। स्लाइड को क्षैतिज रूप से पकड़े हुए, प्रत्येक धब्बा के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घोड़े मूली पेरोक्सिडास डीएबी दृश्य प्रणाली के 150 माइक्रोलीटर लागू करें और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस में पांच मिनट के लिए तीन बार फिर से स्लाइड धोएं ।
फिर 10 सेकंड के लिए हैरिस हेमेटॉक्सीलिन युक्त एक Coplin जार में स्लाइड विसर्जित करके जवाबी कार्रवाई की । नल के पानी में कुल्ला और कागज के साथ थपका अच्छी तरह से सूखने के लिए । स्लाइड को क्षैतिज रूप से पकड़े हुए, धब्बा पर nonaqueous बढ़ते माध्यम की कई बूंदों को लागू करें।
स्लाइड पर एक कवर ग्लास के किनारे रखें, इसे कम करें और किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए धीरे-धीरे दबाएं। एक अच्छी गुणवत्ता वाले धब्बा को अच्छे घनत्व वाली कोशिकाओं के मोनोलेयर द्वारा चिह्नित किया गया था और संरक्षित रूपात्मक विशेषताएं थीं जो मूल के ऊतकों और एक दूसरे के बीच सापेक्ष अनुपात की पहचान के लिए अनुमति देती हैं। इसके अलावा, परजीवी कुशलतापूर्वक इम्यूनो दाग, पहचाने जाने योग्य और गणनीय थे।
गरीब या नकारात्मक ठीक सुई आकांक्षा परिणाम बहुत कम सामग्री के कारण हो सकता है और इस प्रकार द्रव्यमान या अंग के प्रतिनिधि के तहत। यह एक ही स्लाइड पर बहुत अधिक सामग्री के कारण भी हो सकता है जो पीढ़ी मोटी स्मीयर बना रहा है और साइटोलॉजिकल मूल्यांकन को ख़राब कर सकता है। तथाकथित कुचल विरूपण साक्ष्य बहुत अधिक बल लागू किया जा रहा है जब बाधित कोशिकाओं को छोड़ने धब्बा नग्न नाभिक और डीएनए धारियाँ का एक बहुत में जिसके परिणामस्वरूप बना हुआ है के कारण होता है ।
जब धब्बा तैयारी के दौरान पर्याप्त बल लागू नहीं किया जाता है, तो कोशिकाएं एक स्तरीकृत परत के परिणामस्वरूप अलग नहीं होती हैं जो कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं के मूल्यांकन में बाधा डालती हैं। हिस्टोपैथोलॉजी के साथ ठीक सुई आकांक्षा साइटोपैथोलॉजी की तुलना, साइटोपैथोलॉजी को बेहतर संरक्षित सेलुलर आकृति विज्ञान और सापेक्ष अनुपात और कोशिकाओं की गिनती के बेहतर मूल्यांकन का लाभ मिला। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की तुलना में ऑप्टिमाइज़ करने के लिए सरल, तेज और आसान है।
ठीक सुई आकांक्षा के लिए, हमेशा जानवर का एक अच्छा स्थिरीकरण सुनिश्चित करें, अंगों या द्रव्यमान का स्थिरीकरण किया जाए, और एक समन्वित वैक्यूम आवेदन और रिहाई हो। फिर उच्च गुणवत्ता वाले स्मीयरों के लिए, सामग्री को ग्लास पर रखे जाने के तुरंत बाद फैल जाता है और सेल कुचल कलाकृतियों से बचने के लिए धब्बा बनाने के लिए लागू ताकत पर कोमल होना चाहिए। नियमित माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के अलावा, इस सामग्री का उपयोग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, बायोकेमिकल विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री, आणविक जीव विज्ञान, या यहां तक कि इन विट्रो परख के लिए भी किया जा सकता है।
इस तकनीक ने हमें यह प्रदर्शित करने की अनुमति दी कि प्रायोगिक जानवरों में रोग का निदान और अध्ययन करने के लिए ठीक सुई आकांक्षा का उपयोग किया जा सकता है। हम बाहरी पुरुष प्रजनन अंगों के लिए ट्राइपानोसोमा परजीवी के ट्रोपिज्म का निदान करने में सक्षम थे और संक्रमण के दौरान इस बीमारी की विशेषता भी थे।
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