Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Op basis van microfluïde technologie vereisen de isolatie en karakterisering van CTC’s uit de normale bloedcel niet het gebruik van specifieke CTC-biomarkers en is het compatibel met de celkweek. Dit protocol vergemakkelijkt een hoge mate van CTC-extractie en biedt een uitgebreide cytologische analyse van de CTC’s, door kwaadaardige cytomorfologische kenmerken te evalueren. PD-L1 expressie door CTC’s heeft een voorspellende waarde in longkanker management.

Verbetering van de detectie met behulp van deze test zou een beter patiëntenbeheer op lange termijn kunnen bevorderen. Andere toepassing van dit protocol omvat het detecteren van genetische afwijkingen met behulp van FISH, of het uitvoeren van transcriptomische analyse op CTC’s, evenals het isoleren van cellen van foetale oorsprong bij moeders. Het demonstreren van de procedure zal Julie Balandier zijn, een technicus van ons laboratorium.

Voor pre-analytische circulerende tumorcelverrijking, eerst verzamelen 7,5 milliliter bloed in een kalium EDTA buis, en houd het monster onder zachte agitatie om celsedimentatie en stolling te voorkomen. Gebruik binnen zes uur na het verzamelen een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast om tot 7,5 milliliter vol bloed over te brengen in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter en het monster 10 minuten te centrifugeren bij 1600 keer G, bij kamertemperatuur. Gebruik aan het einde van de centrifugatie een overdrachtpipet om de plasmafractie te verzamelen zonder de buffycoat te storen en verdun het plasma met een gelijkwaardig volume PBS, tot 7,5 milliliter.

Voeg vervolgens voorzichtig de buffer van rode bloedcellen toe aan het bloedmonster, aan een uiteindelijk volume van 30 milliliter en draai de bloedafnamebuis voorzichtig drie keer om, voordat u de buis gedurende 10 minuten op kamertemperatuur plaatst. Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen door centrifugatie, en verwijder zorgvuldig alle, behalve de laatste vier tot vijf milliliter supernatant. Gebruik een gefilterde micropipet om de resterende supernatant te verwijderen, en gebruik een P1000 micropipet met een gefilterde tip om een milliliter resuspensie buffer toe te voegen langs de wand van de buis.

Om te voorkomen dat de invoering van bellen, resuspend de cel pellet met zachte pipetting, totdat het monster homogeen is. Wanneer de pellet is opnieuw opgespend, voeg een extra drie milliliter resuspensie buffer aan de wand van de buis, zonder de invoering van bellen, en voorzichtig meng de cellen opnieuw. Voor spiraalmicrofluïdic apparaat circuleren tumorcel verrijking, eerst laden een nieuwe spiraal microfluïde chip op het apparaat, en laad een lege 50 milliliter centrifuge buis in elk van de input en output poorten.

Klik prime om de spiraal microfluïde apparaat prime gedurende drie minuten. Het verwijderen van de invoer- en uitgangsbuizen aan het einde van de cyclus. Laad het opnieuw opgespente bloedmonster in de invoerpoort en laad een duidelijke conische buis van 15 milliliter in de uitgangspoort.

Klik vervolgens op uitvoeren en selecteer programma drie om het 31 minuten durende circulerende tumorcelverrijkingsprogramma te starten. Breng aan het einde van de cyclus de uitgangsbuis over naar de centrifuge en gebruik een serologische pipet van vijf milliliter om alle, behalve de laatste twee milliliter van de supernatant, te verwijderen. Gebruik dan een micropipet om alle, maar de laatste 100 microliters van supernatant te verwijderen.

Voor immunofluorescentie kleuring, tel de cellen in een hemocytometer, en verdun het verrijkte monster tot een een keer tien tot vijfde cellen per 100 microliters van 0,2%anti-bindende oplossing concentratie. Gebruik vervolgens een wattenstaafje gedrenkt met 50 microliter antibindingsoplossing om de contour van de monsterkamer te bevochtigen en plaats een polylysineglasplaat in de monsterkamer. Sluit de kamer en pipet drie keer op en neer om een micropipetpunt met de bindingsoplossing te coaten voordat u het monster in de laatste 100 microliter van de supernatant opnieuw op te geven.

Breng de celoplossing over naar de monsterkamer en cytospin het monster in een speciale centrifuge bij 400 rotaties per minuut gedurende vier minuten, bij een lage versnelling. Plaats aan het einde van de centrifugatie een siliconenisolator rond het gebied van depositie en laat de glijbaan twee minuten drogen onder een microbiologische veiligheidskast en bevestig vervolgens het cytospunmonster met 100 microliters van 4%paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten van twee minuten met 200 microliters PBS per wasbeurt, bij kamertemperatuur. Blokkeer na de laatste wasbeurt elke niet-specifieke binding met 30 minuten incubatie bij het blokkeren van reagens bij kamertemperatuur, gevolgd door etikettering met 100 microliters van de antilichaamoplossing van belang.

Plaats de gelabelde dia in een 100 bij 15 milliliter petrischaal op een stuk absorberend papier bevochtigd met twee milliliter steriel water, en plaats de schotel gesloten, op vier graden Celsius ‘s nachts, beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was het monster drie keer met PBS zoals aangetoond, en monteer het monster met 10 microliter van een geschikte montageoplossing en een glazen deksel slip. Sluit vervolgens de afdekbrief af met een duidelijke nagellak.

Om de cytospunmonsters in beeld te brengen, laadt u de glijbaan op een rechte fluorescerende microscoop met een X Y gemotoriseerd platform en selecteert u een 20x-doelstelling en de juiste kanalen volgens de fluofoforen die worden gebruikt voor de antilichaamlabeling. Zet de kwiklamp aan en pas de microscoop en bijbehorende software aan op een semi-geautomiseerde shoot. Wanneer de lamp klaar is, definieert u in het acquisitiemenu de vier kanalen, stelt u de belichtingstijd in en definieert u de tegels die moeten worden gescand.

Klik op tegels en geavanceerd experiment en definieer het gebied dat moet worden gescand. Pas vervolgens de focus op het scherm aan en klik op experiment starten. Exporteer aan het einde van het experiment de TIF-bestanden voor elk kanaal en noem het bestand specifiek om het voorbeeld, het aantal keren, de kleurstof en het aantal subtegels op te nemen.

Open voor beeldanalyse de software voor beeldanalyse van de website van het Broad Institute en klik op bestand, pijplijn uit bestand en analyse van vier kanalen CTC. Plaats bestanden in de bestandslijst en werk de metagegevens bij om de bestanden op tegels te groeperen. Klik vervolgens op afbeeldingen analyseren om het spreadsheetbestand te openen dat overeenkomt met de parameters voor de intensiteit van de meting.

Zonder het geoptimaliseerde ontsmettingsprotocol wordt hoge bacteriële besmetting waargenomen in weefselculturen van verrijkte A549-cellijnen na slechts 24 uur, waardoor de dood en cytomorfologische veranderingen in de eukaryotische cellen worden veroorzaakt. In tegenstelling, na het reinigingsprotocol, worden levende A549-cellen verkregen in 2D-culturen na 10 uur weefselkweek en gemiddelde verwijdering, onder 3D-kweekomstandigheden en binnen patiëntmonsters. Met behulp van een vloeibare immunofluorescente kleuringstest of een immunofluorescente kleuringstest op met polylysine gecoate glijbanen met cytospin kan een duidelijk onderscheid worden gemaakt in het aantal kernen dat tussen de twee tests is opgesomd.

Zonder de cytospin stap, is het moeilijk om de witte bloedcellen te onderscheiden van de tumorcellen, als gevolg van de wazige contouren in de niet-cytospin cel preps. Hier kunnen de verschillende representatieve bevindingen van verschillende geduldige steekproeven worden waargenomen, met het resterende telling van de witte bloedcellen in het bijzonder bepaald om sterk veranderlijk te zijn, en afhankelijk van het gehele bloedmonster. Een hoge variabiliteit werd ook waargenomen in de circulerende tumorcellen sub-populaties verkregen.

Elke cel op de cytospin wordt geïdentificeerd door de beeldanalysesoftware en maakt het bijhouden van de cel mogelijk en handmatig om de resultaten zo nodig te bevestigen. Een pilotanalyse toonde namelijk een overeenstemming aan tussen de handmatige opsoming en de beeldanalysesoftware opsommding. De opstelling van de in eigen huis ontworpen vochtige petrischaal voor de eiwit-antilichaam hybridisatie is van cruciaal belang, omdat het apparaat voldoende vochtig blijft gedurende de gehele incubatietijd.