Immunology and Infection
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स्वचालित छवि प्रसंस्करण का उपयोग कर विखंडन और Budding खमीर में लिपिड ड्रॉपलेट सामग्री का विश्लेषण
Chapters
Summary July 17th, 2019
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यहाँ, हम स्वचालित पता लगाने और विखंडन और नवोदित खमीर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों में लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विवरण के एक MATLAB कार्यान्वयन प्रस्तुत करते हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की खमीर प्रजातियों में सेलुलर भंडारण लिपिड सामग्री के मात्रात्मक छोटे से बड़े पैमाने पर विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है और निष्पक्ष और मानकीकृत तरीके से ऐसा करता है। तकनीक सूक्ष्म छवियों के तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है और विभिन्न म्यूटेंट और विभिन्न परिस्थितियों में उगाए गए विभिन्न म्यूटेंट और कोशिकाओं जैसे नमूनों की तुलना करने के लिए विस्तृत मात्रात्मक आउटपुट प्रदान करता है। शुरू करने के लिए, धुंधला समाधान, संस्कृति मीडिया, और कोशिकाओं को तैयार करने के लिए साथ पाठ प्रोटोकॉल में साथ पालन करें।
सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को स्वस्थ और वांछित विकास चरण में प्रयोग चलाने से पहले कर रहे हैं । इसके बाद, प्रत्येक नमूने को इमेज करने के लिए एक माइक्रोस्कोप कवरलिप तैयार करें। क्षैतिज रूप से तैनात पिपेट टिप के लंबे हिस्से का उपयोग करके स्लाइड कोटिंग समाधान का एक माइक्रोलीटर एक साफ कवरलिप पर फैलाएं।
कोटिंग समाधान को पूरी तरह से सूखने दें, और फिर कवर्लिप्स को धूल मुक्त वातावरण में स्टोर करें। इसके बाद, सेल संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने, और संस्कृतियों के लिए एक ही विकास चरण में विश्लेषण किया जा करने के लिए, तुलनीय प्रयोगात्मक स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए सभी परीक्षण संस्कृतियों के बीच समान मूल्यों तक पहुंचने की कोशिश करें। फिर, सेल संस्कृति के एक मिलीलीटर को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें।
केवल एस.सेरेविसिया कोशिकाओं के लिए, ट्यूब में स्लाइड कोटिंग समाधान के पांच माइक्रोलीटर भी जोड़ें। फिर, संक्षेप में माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के सभी भंवर, और पांच मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें इनक्यूबेट। इसके बाद, प्रत्येक संस्कृति के लिए लिपिड धुंधला समाधान का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें संक्षेप में भंवर।
फिर, सेल सीमा दृश्य समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें दूसरी बार संक्षेप में भंवर दें। कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 1, 000 बार गुरुत्वाकर्षण पर उन्हें अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए। कताई समाप्त होने पर, सुपरनेट से 950 माइक्रोलीटर निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके शेष सुपरनैट में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
इसके बाद, एक लेक्टिन-लेपित कवरस्लिप पर घने सेल निलंबन के दो माइक्रोलीटर पिपेट करें। फिर, कवरस्लिप को सेल मोनोलेयर बनाने के लिए एक स्वच्छ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें, और इमेजिंग में कलाकृतियों को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके माइक्रोस्कोपी के लिए आगे बढ़ें। माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए मजबूत प्रकाश स्रोतों के लिए लंबे एक्सपोजर की आवश्यकता होती है जो नमूना और तिरछा परिणामों को नुकसान पहुंचा सकता है।
इसलिए, एक समर्पित नमूना स्लाइड का उपयोग करके इमेजिंग शर्तों को सेट करें जो लिपिड ड्रॉपलेट क्वांटिफिकेशन के लिए आगे उपयोग नहीं किया जाएगा। समर्पित नमूने को एक चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोप सेटअप के चरण पर रखें, और कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें। माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर में, जेड-स्टैक सेटिंग्स सेट करें ताकि वे पूरे सेल वॉल्यूम का विस्तार करें।
कुल ऊर्ध्वाधर दूरी सेल आकार पर निर्भर करती है, और ऑप्टिकल स्लाइस की संख्या उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर पर निर्भर करती है। इसके बाद, केंद्रीय फोकल प्लेन के सापेक्ष स्थानांतरित करने के लिए ध्यान केंद्रित करें। लिपिड बूंदों की छवि के लिए, प्रयोगात्मक रूप से हरे चैनल में प्रकाश तीव्रता और जोखिम समय निर्धारित करें।
इमेजिंग करते समय सतर्क रहें, क्योंकि बॉडीपी एक बहुत ही उज्ज्वल फ्लोरोक्रोम है जिसे तेजी से फोटोब्लैच किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ओवरसैचरेशन से बचने के लिए एक्सपोजर समय को कम करें। मोबाइल लिपिड बूंदों को धुंधला करने से रोकने के लिए नीले चैनल पर स्विच करने से पहले पूर्ण हरे चैनल जेड-स्टैक पर कब्जा करें।
छवि सेल सीमाओं के लिए, प्रयोगात्मक नीले चैनल में प्रकाश तीव्रता और जोखिम समय निर्धारित करते हैं । यदि संभव हो, तो मानकीकृत परिस्थितियों में कई नमूनों की इमेजिंग की सुविधा के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एक स्वचालित प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह स्थापित करें और उपयोग करें। महत्वपूर्ण बात, नमूनों के बीच उचित तुलना के लिए अनुमति देने के लिए सभी छवियों को एक ही सेटिंग्स का उपयोग करके प्राप्त किया जाना चाहिए।
एक बार इमेजिंग शर्तों को अनुकूलित किया गया है, कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने और दोनों हरे और नीले चैनलों में उन्हें छवि। मजबूत, प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए प्रति नमूना देखने के कई फ़ील्ड इमेज करें. 16-बिट, मल्टीलेयर झगड़ा फ़ाइलों के रूप में नीले और हरे रंग के चैनल जेड-स्टैक छवियों को सहेजें।
संबंधित फ़ाइल नामों में हरे या नीले शब्दों को शामिल करना सुनिश्चित करें। इमेजजे में सूक्ष्म छवियों को खोलें, और अधिग्रहण के दौरान स्थानांतरित होने वाली काफी संख्या में कोशिकाओं वाले किसी भी छवि के ढेर को हटा दें। ये अलग-अलग जेड वर्गों में अलग-अलग पदों पर दिखाई देते हैं।
इसके बाद, नीले चैनल में अत्यधिक फ्लोरोसेंट गैर-सेल कणों वाले किसी भी छवि के ढेर को हटा दें। यह अक्सर इमेजिंग सतह या खेती के माध्यम में अशुद्धियों पर गंदगी के कारण होता है और उनके आसपास की कोशिकाओं का पता लगाने में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, मृत कोशिकाओं के एक बड़े हिस्से वाले किसी भी छवि के ढेर को हटा दें।
ये छवियां जीवित कोशिकाओं की तुलना में बढ़ी हुई नीली फ्लोरेसेंस के साथ कोशिकाओं को प्रदर्शित करेंगी। जबकि नमूने में कुछ मृत कोशिकाओं की उपस्थिति आम तौर पर एक समस्या नहीं है और इन कोशिकाओं को स्वचालित रूप से विश्लेषण के दौरान खारिज कर रहे हैं, कुछ मृत या मरने वाली कोशिकाओं को कभी-कभी विभाजन एल्गोरिदम द्वारा जीवित कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है और इस प्रकार रिपोर्ट किए गए परिणामों को तिरछा किया जा सकता है। MATLAB में विश्लेषण शुरू करने के लिए, पहले एक मुख्य फ़ोल्डर बनाएं और इस स्थान पर सभी मैटलैब स्क्रिप्ट कॉपी करें।
इसके बाद, विभिन्न खमीर प्रजातियों के नाम के साथ सबफोल्डर बनाएं, और इन स्थानों पर संबंधित झगड़ा छवियों को कॉपी करें। अब, MATLAB शुरू, स्क्रिप्ट मुख्य खोलें। एम, और स्क्रिप्ट चलाते हैं।
मेनू में, खमीर प्रजातियों का विश्लेषण करने और छवि प्रसंस्करण शुरू करने के लिए चुनें। स्प्रेडशीट संपादक या सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग करके आवश्यक आउटपुट फ़ाइलों का निरीक्षण और प्रक्रिया करें। वर्कफ्लो सेमीकॉलन-अलग सीएसवी फाइल्स और सेगमेंट्ड टि्वड फाइल्स का पता लगाया गया सेल ऑब्जेक्ट्स और लिपिड बूंदों के साथ पैदा करता है ।
यहां दिखाया गया है जंगली प्रकार एस pombe कोशिकाओं है कि या तो जटिल हां माध्यम या परिभाषित EMM माध्यम में उगाया गया । हां माध्यम में उगाई जाने वाली कोशिकाओं की तुलना में, ईएमएम माध्यम में कम लिपिड बूंदों और सेल वॉल्यूम की प्रति इकाई उच्च धुंधला तीव्रता का पता लगाया गया था। इसके अलावा, ईएमएम माध्यम में गठित व्यक्तिगत लिपिड बूंदें बड़ी थीं और बढ़ी हुई कुल धुंधला तीव्रता प्रदर्शित की गई थीं।
यह ईएमएम में उगाई जाने वाली कोशिकाओं में बढ़ी हुई संग्रहीत लिपिड सामग्री के पिछले निष्कर्षों के साथ समझौते में है। इसके बाद, ये छवियां यस माध्यम में उगाई जाने वाली घातीय और प्रारंभिक स्थिर संस्कृतियों से एस.जैपोनिकस कोशिकाओं को दिखाती हैं। स्थिर चरण में प्रवेश करने वाली कोशिकाओं ने कोशिका की मात्रा प्रति इकाई लिपिड बूंदों की स्पष्ट रूप से कमी की संख्या को दिखाया जबकि वॉल्यूम-सामान्यीकृत लिपिड ड्रॉपलेट फ्लोरेसेंस तीव्रता दो स्थितियों के बीच थोड़ी कम हो गई ।
प्रारंभिक स्थिर चरण लिपिड बूंदें आम तौर पर आकार में मामूली रूप से बड़ी थीं और तेजी से बढ़ती कोशिकाओं से बूंदों की तुलना में मामूली रूप से अधिक कुल फ्लोरेसेंस तीव्रता थी। S.cerevisiae कोशिकाओं में स्थिर बनाम स्थिर चरण के लिए उगाया जाता है, स्थिर कोशिकाओं में तेजी से बढ़ती कोशिकाओं की तुलना में मात्रा की प्रति इकाई कुछ कम लिपिड बूंदें निहित होती हैं। हालांकि, उनकी मात्रा-सामान्यीकृत बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता लगभग दोगुनी हो गई।
समग्र लिपिड बूंद सामग्री में यह तेज वृद्धि स्थिर चरण में व्यक्तिगत लिपिड बूंदों की मात्रा और बहुत अधिक फ्लोरेसेंस तीव्रता के कारण हुई। इस प्रक्रिया के बाद, आउटपुट डेटा को सांख्यिकीय पैकेज में एकत्रित किया जा सकता है जैसे कि सारांशित परिणामों के भूखंड बनाने और लिपिड ड्रॉपलेट सामग्री में किसी भी देखे गए अंतर पर सांख्यिकीय परीक्षण चलाएं। सिद्धांत रूप में, छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन का उपयोग अन्य सूक्ष्मजीवों में लिपिड बूंद सामग्री के विश्लेषण के लिए या अन्य डॉट-जैसे उपकोशिकीय संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
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