Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyse av lipid dråpe innhold i fisjon og spirende gjær bruker automatisert image processing
Chapters
Summary July 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en MATLAB implementering av automatisert deteksjon og kvantitativ beskrivelse av lipid dråper i fluorescens mikroskopi bilder av fisjon og spirende gjærceller.
Transcript
Denne protokollen forenkler kvantitative små-til-store analyser av cellulært lagring lipidinnhold i en rekke gjærarter og gjør det på en objektiv og standardisert måte. Teknikken gjør det mulig for rask behandling av mikroskopiske bilder og gir detaljerte kvantitative utganger for enkelt å sammenligne prøver som ulike mutanter og celler dyrket under ulike forhold. Til å begynne med følger du med i den medfølgende tekstprotokollen for å forberede fargeløsningene, kulturmediene og cellene.
Sørg for at cellene er sunne og i ønsket vekstfase før du kjører eksperimentet. Deretter forbereder du en mikroskopdekslip for hver prøve som skal avbildes. Spred en mikroliter med glidebeleggoppløsning på en ren dekkglass ved hjelp av langsiden av en horisontalt plassert pipettespiss.
La beleggoppløsningen tørke helt, og oppbevar deretter dekkglassene i et støvfritt miljø. Deretter måler du cellekulturenes optiske tettheter, og for at kulturer skal analyseres i samme vekstfase, prøv å nå lignende verdier blant alle testede kulturer for å sikre sammenlignbare eksperimentelle forhold. Deretter pipette en milliliter av cellekulturen i en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør.
Bare for S.cerevisiae-cellene legger du til fem mikroliter av lysbildebelegget til røret også. Deretter, kort virvel alle mikrocentrifuge rør, og inkubere dem på 30 grader Celsius med risting i fem minutter. Deretter legger du til en mikroliter av lipidfargingsløsningen til hver kultur aliquot, og virvler dem kort.
Deretter legger du til 10 mikroliter av cellegrensevisualiseringsløsningen, og virvler dem kort en gang til. Samle cellene ved å sentrifugere dem på 1000 ganger tyngdekraften i tre minutter ved romtemperatur. Når du er ferdig med å spinne, fjern 950 mikroliter fra det overnaturante og gjenbruk cellene i de gjenværende supernatante ved hjelp av en pipette.
Deretter pipette to mikroliter av tett celle suspensjon på en lectin-belagt coverslip. Deretter plasserer du dekkslippen på et rent mikroskoplysbilde for å danne en cellemonolag, og fortsett til mikroskopi så raskt som mulig for å minimere artefakter i bildebehandling. Oppsett av mikroskopet krever lange eksponeringer for sterke lyskilder som kan forårsake skade på prøven og skjevt resultater.
Derfor kan du konfigurere bildeforholdene ved hjelp av et dedikert prøvelysbilde som ikke vil bli ytterligere brukt til lipiddråpekvantifisering. Plasser den dedikerte prøven på scenen i en fasekontrast eller differensial interferenskontrastmikroskopoppsett, og fokuser på cellene. I mikroskopets programvare angir du Z-stakkinnstillingene slik at de strekker seg over hele cellevolumet.
Den totale vertikale avstanden avhenger av cellestørrelsen, og antall optiske skiver avhenger av målsettingens numeriske blenderåpning. Deretter setter du fokus for å bevege seg i forhold til det sentrale fokalplanet. For å bilde lipiddråper, still inn lysintensiteten og eksponeringstiden eksperimentelt i den grønne kanalen.
Vær forsiktig når avbildning, da BODIPY er en veldig lys fluorokrom som raskt kan fotobleached. I tillegg minimere eksponeringstiden for å unngå overmetning. Fang opp den grønne kanalen Z-stakken først før du bytter til den blå kanalen for å unngå uskarphet av de mobile lipiddråpene.
Til bildecellegrenser angir du eksperimentelt lysintensiteten og eksponeringstiden i den blå kanalen. Hvis det er mulig, kan du konfigurere og bruke en automatisert eksperimentell arbeidsflyt i mikroskopkontrollprogramvaren for å lette avbildning av flere prøver under standardiserte forhold. Viktigere, alle bilder må anskaffes ved hjelp av de samme innstillingene for å tillate riktig sammenligning mellom eksempler.
Når bildeforholdene er optimalisert, fokuserer du på cellene og bilde dem i både de grønne og blå kanalene. Bilde flere synsfelt per eksempel for å få robuste, representative data. Lagre den blå og grønne kanalen Z-stabel bilder som 16-bit, flerlags TIFF-filer.
Pass på å inkludere ordene grønne eller blå i de tilsvarende filnavnene. Åpne mikroskopiske bilder i ImageJ, og fjern eventuelle bildestabler som inneholder et betydelig antall celler som beveget seg under oppkjøpet. Disse vises i forskjellige posisjoner i individuelle Z-seksjoner.
Deretter fjerner du eventuelle bildestabler som inneholder svært fluorescerende ikke-cellepartikler i den blå kanalen. Dette skyldes ofte smuss på bildeoverflaten eller urenheter i dyrkingsmediet og kan forstyrre påvisning av celler i deres nærhet. Fjern også eventuelle bildestabler som inneholder en stor andel døde celler.
Disse bildene vil vise celler med økt blå fluorescens sammenlignet med de levende cellene. Mens tilstedeværelsen av noen døde celler i prøven er vanligvis ikke et problem, og disse cellene blir automatisk kassert under analyse, noen døde eller døende celler kan noen ganger bli anerkjent som levende celler av segmentering algoritmen og dermed skjev de rapporterte resultatene. For å starte analysen i MATLAB, må du først opprette en hovedmappe og kopiere alle MATLAB-skript til denne plasseringen.
Deretter oppretter du undermapper med navnene på de ulike gjærartene, og kopierer de respektive TIFF-bildene til disse stedene. Start MATLAB, åpne manuset MAIN. m, og kjøre skriptet.
I menyen velger du gjærartene som skal analyseres, og start bildebehandling. Inspiser og behandle utdatafilene etter behov ved hjelp av et regnearkredigeringsprogram eller en statistisk pakke. Arbeidsflyten produserer semikolondelte CSV-filer og segmenterte TIFF-filer med oppdagede celleobjekter og lipiddråper.
Vist her er wild-type S.pombe celler som ble dyrket i enten det komplekse YES-mediet eller det definerte EMM-mediet. Sammenlignet med celler dyrket i YES-mediet, ble færre lipiddråper og høyere fargingsintensitet per enhet av cellevolum oppdaget i EMM-mediet. Videre var individuelle lipiddråper dannet i EMM-medium større og viste økt total fargeintensitet.
Dette er i samsvar med tidligere funn av økt lagret lipidinnhold i celler dyrket i EMM. Deretter viser disse bildene S.japonicus celler fra eksponentielle og tidlig stasjonære kulturer dyrket i YES medium. Celler som kom inn i stasjonær fase viste et markert redusert antall lipiddråper per enhet av cellevolum, mens volum-normalisert lipid dråpe fluorescens intensiteten redusert litt mellom de to forholdene.
De tidlige stasjonære lipiddråpene var vanligvis moderat større i størrelse og hadde moderat høyere total fluorescensintensitet sammenlignet med dråper fra eksponentielt voksende celler. I S.cerevisiae celler vokst til eksponentiell versus stasjonær fase, stasjonære celler inneholdt noe færre lipid dråper per volumenhet sammenlignet med eksponentielt voksende celler. Imidlertid ble deres volum-normaliserte dråpefluorescensintensitet nesten doblet.
Denne kraftige økningen i det totale lipiddråpeinnholdet skyldtes den mye høyere fluorescensintensiteten og volumet av individuelle lipiddråper i stillestående fase. Etter denne fremgangsmåten kan utdata aggregeres i en statistisk pakke, for eksempel R, for å opprette plott med oppsummerte resultater og kjøre statistiske tester på eventuelle observerte forskjeller i lipiddråpeinnhold. I prinsippet kan bildebehandlingsrørledningen brukes til analyse av lipiddråpeinnhold i andre mikroorganismer eller for å analysere andre punktlignende subcellulære strukturer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
