Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Анализ содержания капель Lipid в делении и подающих надежды дрожжах с использованием автоматизированной обработки изображений
Chapters
Summary July 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы представляем MATLAB реализации автоматизированного обнаружения и количественного описания липидных капель в флуоресценционной микроскопии изображения деления и подающий надежды дрожжевых клеток.
Transcript
Этот протокол облегчает количественный мелко-масштабный анализ содержания липидов клеточного хранения в различных видах дрожжей и делает это непредвзято и стандартизировано. Техника позволяет быстро обрабатывать микроскопические изображения и обеспечивает подробные количественные результаты, чтобы легко сравнить образцы, такие как различные мутанты и клетки, выращенные в различных условиях. Для начала следуйте в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы подготовить решения для окрашивания, культурные средства массовой информации и клетки.
Убедитесь, что клетки здоровы и находятся в желаемой фазе роста до запуска эксперимента. Затем подготовьте обложку микроскопа для каждого образца, который будет изображен. Распространение одного микролитров слайд-покрытия раствора на чистый coverslip с помощью длинной стороны горизонтально расположены пипетки отзыв.
Разрешить покрытие раствор полностью высохнуть, а затем хранить крышки в без пыли окружающей среды. Далее, измерить оптическую плотность клеточных культур, и для культур, которые будут проанализированы в той же фазе роста, попытаться достичь аналогичных значений среди всех проверенных культур для обеспечения сопоставимых экспериментальных условий. Затем пипетка один миллилитр клеточной культуры в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Только для клеток S.cerevisiae добавьте в трубку пять микролитров раствора слайд-покрытия. Затем, кратко вихрем все микроцентрифуг трубки, и инкубировать их при 30 градусов по Цельсию с встряхивания в течение пяти минут. Далее добавьте один микролитер раствора липидного окрашивания в каждую культуру aliquot, и вихрь их кратко.
Затем добавьте 10 микролитров раствора визуализации границы ячейки и кратко вихрем во второй раз. Соберите клетки путем центрифугирования их при 1000 раз тяжести в течение трех минут при комнатной температуре. Когда закончите вращаться, удалить 950 микролитров из супернатанта и повторно использовать клетки в оставшихся supernatant с помощью пипетки.
Далее, пипетки два микролитров плотной клеточной подвески на лектин покрытием крышки. Затем поместите крышку на чистый слайд микроскопа, чтобы сформировать монослой клетки, и перейти к микроскопии как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты в изображении. Настройка микроскопа требует длительного воздействия сильных источников света, которые могут привести к повреждению образца и искажению результатов.
Таким образом, настроить условия изображения с помощью выделенного слайда образца, который не будет использоваться для количественной оценки липидных капель. Поместите выделенный образец на стадию установки контрастного или дифференциального интерференционного микроскопа и сосредоточьтесь на клетках. В программном обеспечении микроскопа установите настройки стека, чтобы они охватывают весь объем ячейки.
Общее вертикальное расстояние зависит от размера ячейки, а количество оптических срезов зависит от численного отверстия цели. Затем установите фокус для перемещения по отношению к центральной фокусной плоскости. Для изображения липидных капель, экспериментально установить интенсивность света и время экспозиции в зеленом канале.
Будьте осторожны при визуализации, так как BODIPY является очень ярким флюорохромом, который может быть быстро фотоотвеч. Кроме того, свести к минимуму время экспозиции, чтобы избежать перенасыщения. Захват полного зеленого канала - стек, прежде чем перейти на синий канал, чтобы предотвратить размытие мобильных липидных капель.
Для границ клеток изображения экспериментально установите интенсивность света и время экспозиции в синем канале. По возможности на настройку и использование автоматизированного экспериментального рабочего процесса в программном обеспечении для управления микроскопом для облегчения визуализации нескольких образцов в стандартизированных условиях. Важно отметить, что все изображения должны быть получены с использованием тех же параметров, чтобы обеспечить надлежащее сравнение между образцами.
После оптимизации условий визуализации сосредоточьтесь на клетках и изумите их как в зеленых, так и в синих каналах. Изображение нескольких полей зрения на выборку для получения надежных репрезентативных данных. Сохранить синий и зеленый канал - стек изображения, как 16-битный, многослойный TIFF файлов.
Обязательно включите слова зеленый или синий в соответствующие имена файлов. Откройте микроскопические изображения в ImageJ и удалите все стеки изображений, содержащие значительное количество ячеек, которые перемещались во время приобретения. Они отображаются на разных позициях в отдельных разделах.
Затем удалите все стеки изображений, содержащие высокофлуоресцентные неклеточные частицы в синем канале. Это часто вызвано грязью на поверхности изображения или примесями в среде культивирования и может помешать обнаружению клеток в их окрестностях. Кроме того, удалите все стеки изображений, содержащие большую часть мертвых ячеек.
На этих изображениях будут отображаться клетки с повышенной синей флуоресценцией по сравнению с живыми клетками. Хотя наличие нескольких мертвых клеток в образце, как правило, не является проблемой, и эти клетки автоматически отбрасываются во время анализа, некоторые мертвые или умирающие клетки иногда могут быть признаны живыми клетками алгоритмом сегментации и, таким образом, исказить результаты. Чтобы начать анализ в MATLAB, сначала создайте основную папку и скопировать все скрипты MATLAB в это место.
Затем создайте субфолдеры с названиями различных видов дрожжей и скопируйте соответствующие изображения TIFF в этих местах. Теперь начните MATLAB, откройте скрипт MAIN. м, и запустить сценарий.
В меню выберите вид дрожжей для анализа и начните обработку изображений. Проверка и обработка выходных файлов по мере необходимости с помощью редактора электронной таблицы или статистического пакета. Рабочий процесс производит полуколонированные файлы CSV и сегментированные файлы TIFF с обнаруженными клеточными объектами и липидными каплями.
Здесь показаны клетки дикого типа S.pombe, выращенные либо в сложной среде YES, либо в определенной среде EMM. По сравнению с клетками, выращенными в среде YES, в среде EMM было обнаружено меньше липидных капель и более высокая интенсивность окрашивания на единицу объема клеток. Кроме того, отдельные липидные капли, образуюющиеся в среде ЭММ, были крупнее и демонстрировали повышенную общую интенсивность окрашивания.
Это в согласии с предыдущими выводами увеличения содержания липидов в клетках, выращенных в ЭММ. Далее на этих снимках показаны клетки S.japonicus из экспоненциальных и ранних стационарных культур, выращенных в среде YES. Клетки, поступающие в стационарную фазу, показали заметное снижение количества липидных капель на единицу объема клеток, в то время как нормализоваемая интенсивность липидной капли флуоресценции несколько снизилась между двумя условиями.
Ранние стационарные фазы липидных капель, как правило, умеренно больше по размеру и умеренно выше общая интенсивность флуоресценции по сравнению с каплями из экспоненциально растущих клеток. В S.cerevisiae клетки выросли до экспоненциальной по сравнению со стационарной фазы, стационарные клетки содержали несколько меньше липидных капель на единицу объема по сравнению с экспоненциально растущих клеток. Тем не менее, их объем нормализованных капель флуоресценции интенсивность почти в два раза.
Это резкое увеличение общего содержания липидных капель было связано с гораздо более высокой интенсивностью флуоресценции и объемом отдельных липидных капель в стационарной фазе. Следуя этой процедуре, выходные данные могут быть агрегированы в статистическом пакете, таком как R, для создания участков обобщенных результатов и проведения статистических тестов на любые наблюдаемые различия в содержании липидных капель. В принципе, конвейер обработки изображений может быть использован для анализа содержания липидных капель в других микроорганизмах или для анализа других точечных субклеточных структур.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
