Immunology and Infection
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En luciferase-fluorescerende reporter influenza virus til levende billeddannelse og kvantificering af viral infektion
Chapters
Summary August 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Influenza A-vira (IAVs) er smitsomme luftvejs patogener, der forårsager årlige epidemier og lejlighedsvis pandemier. Her beskriver vi en protokol til at spore virale infektioner in vivo ved hjælp af en roman rekombinant der og fluorescens-udtrykker bi-reporter iav (birflu). Denne fremgangsmåde giver forskerne et glimrende værktøj til at studere IAV in vivo.
Transcript
Forskere har tidligere genereret rekombinant influenza virus, der udtrykker enten fluorescerende eller bioluminescerende protein reportere. En del af vores enkelt udtryk for reporter gener i influenzavirus alvorligt begrænser dens anvendelse i eksperimenter. Vores protokol beskriver brugen af bireporter influenza virus, der udtrykker både fluoresent og bioluminescerende reporter gener, og derfor overvinder sin begrænsning.
Den største fordel ved denne teknik er brugen af et enkelt rekombinant influenzavirus til in vitro- og in vivo-undersøgelser. Når du udfører denne teknik, hurtig injektion af luciferase substrat og korrekt planlægning af mus håndtering er vigtig, fordi substratet er hurtigt metaboliseres. Også, barbering af mus anbefales at forbedre påvisning af bioluminescerende signal.
For at inficere musene skal du starte med at forberede BIRFLU i 1X PBS. Vedligehold virus på is indtil vaccination. Kontroller, om tåens knivspidsrefleks ikke er til stede for at sikre, at musen bedøves, og inokuler den intranasalt med den forberedte BIRFLU-fortynding.
Sørg for, at alle mus trækker vejret ordentligt, før de returneres til deres bure. Åbn billedsoftwaren, og tryk på Initialiser, og angiv derefter de parametre, der skal bruges til billedbehandling. For at overvåge mus inficeret med BIRFLU, barbere deres bryst for at forbedre påvisning af det bioluminescerende signal.
Når musene er bedøvet, bruge en 22 gauge nål til retro-orbitalt administrere 100 mikroliter af Nluc luciferase substrat, fortyndet en til 10 i PBS. Umiddelbart efter injektionen skal dyrene i isolationskammeret med brystet opad. Derefter skal du placere isolationskammeret i billedinstrumentet, lukke døren og hente billeder.
Efter billeddannelse, returnere musene til deres bure og overvåge dem, indtil de er fuldt tilbagebetalt. Brug værktøjet til investeringsafkast af billedbehandlingssoftware til at analysere de erhvervede bioluminescensdata ved at udpege et område af interesse og klikke på mål. For at udføre ex vivo billeddannelse af muselunger, indsamle lungerne i henhold til manuskriptet retninger, starte billedet erhvervelse software, og indstille parametrene for billedbehandling.
Når maskinen er initialiseret, skal lungerne i en sort baggrundsbakke, og sikre, at vævene er adskilt fra hinanden. Indfør bakken i imageren, luk døren, og ansk af billederne. Efter billeddannelse fjernes vævsvævet straks og opbevares på is ved fire grader Celsius, hvis prøverne vil blive behandlet samme dag.
Hvis de vil blive behandlet senere, fryse dem hurtigt i et rør på tøris, og gemme dem på 80 grader Celsius. Hvis du vil behandle billederne, skal du vælge værktøjet INVESTERINGSAFKAST, tegne interesseområder omkring hver af de enkelte lunger og klikke på målpunkt. BIRFLU har været karakteriseret in vitro ved at bestemme Venus, Nluc, og NP ekspressionsniveauer i inficerede celler.
Venus og Nluc udtryk påvises kun i celler inficeret med BIRFLU, mens NP udtrykkes i både vildtype PR8 og BIRFLU-inficerede celler. Intet udtryk observeres i mock-inficerede celler. Desuden er Nluc-aktiviteten blevet målt i vævskultursupernatanter ved 24, 48, 72 og 96 timer efter infektionen.
Det opdages så tidligt som 24 timer efter infektion, og udtrykket niveauer stige på 96 timer. Det kan også påvises, at replikation kinetik af BIRFLU kan sammenlignes med den vilde type PR8 virus. BIRFLU har evnen til at udtrykke både fluorescerende og bioluminescerende reporter gener, og sammenhængen mellem de to kan vurderes ved hjælp af in vivo og ex vivo imaging af en mus lunge.
Lungerne af mus inficeret med BIRFLU viste høj bioluminescens in vivo og fluorescens ex vivo. Virale titere og genetisk stabilitet af BIRFLU in vivo er også blevet bestemt. Plaque assays på virus fra mus lunger viste, at virus kan danne plaques og udtrykke både reporter gener.
BIRFLU kan også anvendes til at evaluere effektiviteten af antivirale og neutraliserende antistoffer mod influenza. Outputtet fra disse analyser alle var korreleret med hinanden og er hurtige og nemme at gøre.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
