使用锚定多路聚合酶链反应的致癌基因融合检测,随后进行下一代测序

该协议用于检测患者肿瘤样本的信息化基因融合。在一次检测中同时评估数十个基因的融合状态。这项技术的优点是，我可以识别基因融合，而不管融合伙伴的身份如何，这些融合伙伴来自通过配方固定处理的肿瘤样本。

临床肿瘤样本中某些基因融合的检测直接为多种癌症类型的诊断、预后和治疗选择提供信息。了解分析算法调用的许多融合都是工件至关重要。分析数据时最困难的任务是区分工件和实际融合调用。

首先稀释总核酸，以达到RNA的所需浓度。对于每个样品，将20微升稀释剂转移到预冷却铝块中的随机注注试剂条管中，通过上下移液6至8次混合。简要旋转样品，将整个体积转移到 96 井 PCR 板中，然后用板密封膜密封。

将板插入热循环器，用压缩垫盖住，然后合上盖子。在65摄氏度下孵育5分钟。孵育后，将第一链试剂条管中随机注注产品的全部体积转移。

通过上下移液和短暂旋转混合。将整个体积转移到 96 井 PCR 板中，并用 RT 薄膜密封。将板插入热循环器，然后根据手稿指示运行反应。

执行第二股cDNA合成，并修复，并结合步骤一根据手稿指示，并进入第二结扎步骤。要对分子条形码或 MBC 适配器条管进行编号，请将带铰链的管水平定位到背面，并使用永久标记。将珠子纯化板从第一个结扎步骤中取出，将每个样品的 40 微升转移到 MBC 适配器条管中，注意不要干扰珠子颗粒。

通过移液混合试剂，向下旋转管，将整个体积转移到连接步骤两个试剂条管。混合样品，旋转下来，并放在热循环器块中。关闭加热盖，在 22 摄氏度下运行热循环器 5 分钟，然后保持 4 摄氏度。

接下来，通过旋转和将50微升到一组新的PCR条管中，准备结扎清理珠子。在磁铁上孵育一分钟，丢弃上一液。从磁铁上取下带状管，通过上下移液将珠子重新插入 50 微升的结扎清洁缓冲液中。

将整个样品体积从第二个结扎步骤转移到结扎清理珠条中。将样品混合并留在室温下10分钟。在孵育的中途对样品进行涡旋。

之后，旋转样品，旋转下来，并在磁铁上孵育一分钟。丢弃上流液，并添加 200 微升新鲜结扎清理缓冲液。漩涡重新暂停，旋转下来，并放在磁铁上一分钟。

两次洗涤后，使用超纯水代替缓冲液进行第三次洗涤。将珠子重新在 20 微升 5 毫米氢氧化钠中，然后将样品转移到 96 井 PCR 板中。将板放入带压缩垫的热循环器中，在 75 摄氏度下运行 10 分钟，然后保持 4 摄氏度。

样品冷却至 4 摄氏度后，将板放在磁铁上至少 3 分钟，然后继续使用第一个 PCR。通过将两个微升的 GSP1 底因器添加到第一个 PCR 试剂条的每个井中来准备 PCR 反应。将第二次结扎清理产品的 18 微升转移到第一个 PCR 试剂条管中，然后上下移液混合。

旋转样品并转移到 96 井 PCR 板。将它们放入热循环器中，然后根据手稿指示运行 PCR。通过将 PCR 产品的 20 微升添加到每个井填充 24 微升纯化珠的 U 底板中，继续进行珠子纯化。

上下移液混合，在室温下离开板五分钟，然后孵育磁铁上的板两分钟。丢弃珠子中的上一分，用200微升70%乙醇洗涤两次。最后洗涤后，取出所有乙醇，让样品干燥两分钟。

从磁铁上取下磁石，将珠子重新用 24 微升 10 毫米 Tris-HCl 和 pH 8.0。孵育磁铁三分钟，然后将板放回磁铁上两分钟。在 10 毫米 Tris-HCl 中制备第二个 PCR 产品的 1 到 5 个稀释度，开始库定量。

在 10 毫米 Tris-HCl 中连续稀释 1:199、1:199 和 20:80，并添加 05% 聚索酸酯。通过将六微升主混合添加到光学 96 井板的每个井中，然后加入 4 个适当稀释或标准的微升来设置关键 PCR。旋转板并加载到 qPCR 仪器中。

根据手稿指示执行 qPCR。库定量完成后，将所有库稀释为两个纳米摩尔，并配有 10 毫米 Tris-HCl。通过将每个规范化库的 10 微升组合成一个 1.5 毫升的微离心管，制作库池。

接下来，准备变性安培库，或DAL池，将库池的10微升与10微升的0.2正常氢氧化钠相结合，并在室温下孵育混合物5分钟。孵育后，在pH 7.0下加入10微升200毫米Tris-HCl，然后加入970微升HT1杂交缓冲液。通过组合 300 微升 HT1、25 微升 20 个 picomolar PhiX 和 675 微升的 DAL 池，制作最终负载管。

将负载管的整个体积添加到测序器试剂盒的样品井中，并将墨盒加载到测序器中。首先选择阳性对照样本，并确保检测到所有预期的聚变和致癌异构体，并列在强证据选项卡中。对于每个示例，检查每个 GSP2 控制值的平均唯一启动站点，然后通过单击可视化链接来可视化每个潜在融合的支持读取，该链接将用户带至基于 Web 的 JBrowse 视图，该视图包含单个融合支持读取的堆积。

确认读取大多没有不匹配，但超过 30 个读取基础与融合伙伴对齐，并且与基因和底像绑定位点之间的断点相邻的序列没有插入或删除。确保每个呼叫融合通常没有错位，并且读取的很大一部分与融合伙伴保持一致至关重要。该协议已用于研究肺腺癌样本中的基因融合状态。

摘要显示了强大的证据融合，”读取统计”页显示样本的指标。该样品表现出良好的RNA质量，因此如果没有发现聚变，将报告阴性结果。合法的融合调用具有大量支持读取、支持融合的底像读取率高以及大量启动站点。

读取的可视化显示与融合伙伴的大区域良好的对齐方式。相反，在映射到合作伙伴时，工件融合调用具有较低的支持指标和高错误率。分析算法进行的项目融合调用很常见。

手动检查每个呼叫，以确保它代表患者样本中真正的基因融合至关重要。