Tumorsphere Afberegning og behandling fra primære tumor celler isoleret fra mus Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma er en sjælden form for bløddelssarkomer karakteriseret histologisk ved væv morfologi og udtryk for myogene markører. Men i betragtning af eksistensen af forskellige undertyper af disse tumorer og heterogenitet af stimuli, der bidrager til dens dannelse, identifikation af oprindelsescellen har været meget udfordrende. Her beskriver vi reproducerbare og pålidelige metoder til identifikation af oprindelsescellen af rhabdomyosarcomas startende fra frisk høst tumorvæv fra mus og denne analyse er tumorsfæren dannelse assay.

De vigtigste fordele ved tumorsfære dannelse assay er, at det er afhængig af cellulære egenskaber, der er kendt for at være til stede i tumor-oprindelse celler, og det kan også bruges til ekspansion og berigelse af den specifikke cellepopulation. Endvidere, dens sfæroide struktur efterligne tumor miljø, således de kan bruges som narkotika-screening undersøgelser. Denne metode har potentiale til at blive anvendt på andre type tumorer, fordi det ikke kræver forudgående kendskab til molekylære markører, men det kan kræve optimering af kulturbetingelser.

Tumorsfære kan tage lidt tid at danne, især hvis du forsøger at identificere en sjælden celle befolkning i din tumor. Således er det ikke foreslået at se på din subkultur plade hver dag, da det kan have en negativ indvirkning på resultaterne af dine eksperimenter. Start med at opvarme en 10-centimeter plade med fem milliliter isolationsmedier i en inkubator ved 37 grader Celsius.

Afveje 500 til 1, 000 milligram af tumorvæv og læg det i pladen. Bring pladen med tumorvævet til en steril kultur hætte og hakke det med et barberblad. For optimal fordøjelse, skal du sørge for, at størrelsen af de hakkede stykker er ensartede.

Det hakkede vævs- og celleisolationsmedie overføres til et centrifugerør med 15 milliliter. Vask pladen med yderligere fire milliliter medier og tilsæt det til røret. Tilsæt 700 enheder pr. milliliter kollagenopløsning til røret og inkuber det i et rystende vandbad ved 37 grader Celsius i 1 1/2 time.

Efter inkubationen drejes vævet ned ved 300 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Inspirer supernatanten uden at forstyrre pellet, derefter resuspend pellet i 10 milliliter anden fordøjelse opløsning og inkubere i rystende vandbad i 30 minutter mere. Efter den anden fordøjelse, pipette celle suspension op og ned og passere det gennem en 70-mikrometer nylon filter på en 50-milliliter centrifuge rør.

Derefter vaskes filteret med 10 milliliter celleisoleringsmedier, og vævet drejes 300 gange g i fem minutter. Inspirer supernatanten og opsplit pellet i 20 milliliter tumorcellemedier. Overfør suspensionen til en 15-centimeter kultur plade og placere cellerne i en 37 grader Celsius inkubator natten over.

På den næste dag, ændre medierne for at fjerne snavs og døde celler, der kan have en negativ indflydelse på cellernes overlevelse. På dette tidspunkt skal du vurdere cellekanalen og lade cellerne vokse i inkubatoren, indtil den når 90%Monitor cellerne hver dag og ændre medierne hver anden dag. For tumorsfære afledning, bruge celler på Passage P1 eller P2 for at undgå celle udvælgelse gennem flere passager.

Vask celleskålen med PBS, og dæk dem derefter til med løsrivelsesopløsning. Læg dem i inkubatoren i fem til 10 minutter og bekræft derefter løsrivelse ved at se på pladen under et lysfeltmikroskop. Når cellerne er afmonteret, tilføje tumor cellemedier til pladen og overføre celle suspension til en centrifuge rør.

Spin cellerne ned på 300 gange g i fem minutter, fjerne supernatant, og resuspend cellerne i tumorsfære medier. Når cellerne er resuspenderet, skal du tælle dem ved hjælp af Trypan blue og beregne cellekoncentrationen. Plade det korrekte antal celler i en 96-godt lav-vedhæftet plade og placere cellerne i inkubatoren indtil udgangen af forsøget, idet pas på ikke at forstyrre pladen, medmindre genopfyldning medier.

Efter afslutningen af eksperimentet, identificere tumorsfærer manuelt under en brightfield mikroskop eller ved hjælp af Celigo software. Antallet og størrelsen af tumorsfærer kan evalueres som et resultat af denne analyse. For at forberede tumorsfærer til allograft transplantation, samle alle tumorsfærer opnået fra en bestemt celletype eller behandling.

Centrifuge tumorerster og forsigtigt fjerne supernatant med en en-millimeter pipette efterfulgt af en 200-mikroliter pipette, derefter vaske dem med 10 milliliter sterile PBS. Drej tumorsfærerne ned igen og aspirere PBS. Tilføj 500 mikroliter til en milliliter celleløsning på toppen af tumorsfærepillepellen og inkuber cellerne i et rystende vandbad ved 37 grader Celsius.

Kontroller udviklingen af fordøjelsen hvert 10. Hele processen gør tage op til 30 minutter. Hvis fordøjelsen af tumorsfære i rystende vandbad er ikke nok til at opnå en enkelt-celle løsning, mekanisk afbrydelse gennem pipettering op og ned er foreslået.

Bemærk, at efter spinding tumorsfærer ikke danner en stabil pellet, så aspirerende supernatant bør gøres omhyggeligt med en en-milliliter pipette og 200-mikroliter pipetter. Når en enkeltcelleløsning er opnået, tilsættes en mængde tumorcellemedier og drej det ned ved 300 gange g i fem minutter ved 4 grader Celsius. Efter denne centrifugering skal alle efterfølgende trin udføres på is.

Resuspend cellerne i kolde tumor cellemedier og tælle levende celler ved hjælp af Trypan blå udelukkelse. Bestem det korrekte antal celler til allograft og fortynde det i 50 mikroliter af kolde tumorcellemedier. Placer en pipette spids i kolde tumor cellemedier til at køle det og derefter bruge den til at tage 50 mikroliter af kold ECM-løsning og tilføje det til røret med celler, og sørg for ikke at fjerne ECM rør fra is under denne proces.

Vedligehold cellerne på is indtil transplantation og læg en udjævnet, 0,5-milliliter insulinsprøjt med en 29-gauge nål på is. Efter bekræftelse af, at musen er blevet ordentligt bedøvet, barbere højre side af dyret, aspirere celleopløsningen i den afkølede sprøjte, og injicere cellerne subkutant i det barberede område. Hvis injektionen udføres korrekt, vil der dannes et synligt bump under huden.

Denne protokol kan bruges til pålideligt form tumorsfærer til identifikation af sjældne cellepopulationer, der er ansvarlige for blødt væv sarkom udvikling. En grundlæggende del af denne analyse er diskrimination mellem tumorsfærer og celleklynger, som udviser klare morfologiske forskelle. For at bestemme den optimale koncentration, hvor et protein af interesse udløser en effekt på tumorceller, er det nødvendigt at vurdere niveauet af udtryk for proteinets downstream mål.

Tre af de testede gener viste en dosisafhængig respons på rekombinant proteinbehandling, og det gjorde en ikke. For at etablere en effektiv protokol blev virkningerne af transinfektion på iboende tumorceller analyseret;to forskellige mængder reagens blev testet, og effektiviteten blev vurderet med en GFP-reporter plasmid. Lavere mængder reagens resulterede i højere transfektionseffektivitet.

En to-trins protokol skulle gennemføres for at udføre transfektion på celler i suspension. Transinfektion blev udført på tilsluttede celler og 24 timer senere blev de løsrevet og belagt i suspension;efter syv dage, kontrollerede tumorsfærer var udtryk GFP. Efter tumorsfærer er opnået, behandlet, og transplanteret er det muligt at sammenligne effekten af denne forskellige behandling i tumorvækst in vivo.

Disse metoder vil gøre det muligt for forskerne at besvare de stadig stående spørgsmål om rhabdomyosarcomas’ oprindelsescelle, samtidig med at de danner grundlag for lægemiddelscreening.