Tumorsphere härledning och behandling från primära tumörceller isolerade från mus Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma är en sällsynt form av mjuk-vävnad sarkom kännetecknas histologiskt av vävnad morfologi och uttryck av myogenic markörer. Med tanke på förekomsten av olika subtyper av dessa tumörer och heterogeniteten hos de stimuli som bidrar till dess bildande har emellertid identifieringen av ursprungscellen varit mycket utmanande. Här beskriver vi reproducerbara och tillförlitliga metoder för identifiering av ursprungscellen av rhabdomyosarcomas börjar från nyligen skörd tumör vävnader från möss och denna analys är den tumorsphere formation assay.

De främsta fördelarna med tumorsphere formation assay är att den bygger på cellulära egenskaper som är kända för att vara närvarande i tumör-ursprung celler och det kan också användas för expansion och anrikning av den specifika cellpopulationen. Vidare, dess sfäroid struktur efterlikna tumörmiljön, alltså de kan användas som drog-screening studier. Denna metod har potential att tillämpas på andra typ av tumörer eftersom det inte kräver förkunskaper om molekylära markörer men det kan kräva optimering av kultur villkor.

Tumorsphere kan ta lite tid att bilda, särskilt om att försöka identifiera en sällsynt cellpopulation inom din tumör. Således är det inte föreslås att titta på din subkultur tallrik varje dag, eftersom det kan negativt påverka resultaten av dina experiment. Börja med att värma upp en 10-centimetersplatta med fem milliliter isoleringsmedia i en inkubator vid 37 grader Celsius.

Väg 500 till 1, 000 milligram av tumörvävnaden och placera den i plattan. Ta plattan med tumörvävnaden till en steril odlingshuva och finhacka den med ett rakblad. För optimal matsmältning, se till att de malda bitarnas storlekar är enhetliga.

Överför mald vävnad och cell isolering media till en 15-milliliter centrifug röret. Tvätta plattan med ytterligare fyra milliliter media och lägg till det i röret. Tillsätt 700 enheter per milliliter kollagenaslösning till röret och inkubera den i ett skakvattenbad vid 37 grader Celsius i 1 1/2 timme.

Efter inkubationen snurrar du ner vävnaden med 300 gånger g i fem minuter i rumstemperatur. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten, sedan återanvända pelleten i 10 milliliter andra matsmältningslösning och inkubera i skakningsvattenbadet i 30 minuter till. Efter den andra matsmältningen pipettera cellupphängningen upp och ner och för det genom ett 70-mikrometers nylonfilter på ett 50-milliliter centrifugrör.

Tvätta sedan filtret med 10 milliliter cellisoleringsmedia och snurra ner vävnaden med 300 gånger g i fem minuter. Aspirera supernatant och resuspend pelleten i 20 milliliter av tumör cell media. Överför suspensionen till en 15-centimeters odlingsplatta och placera cellerna i en 37 grader Celsius inkubator över natten.

På nästa dag, ändra media för att ta bort skräp och döda celler som negativt kan påverka cellernas överlevnad. Vid denna punkt, bedöma cellkonfluensans och låt cellerna att växa i inkubatorn tills den når 90%Övervaka cellerna varje dag och byta media varannan dag. För tumörsfärens härledning, använd celler vid Passage P1 eller P2 för att undvika cellval genom flera passager.

Tvätta cellfatet med PBS och täck dem sedan med lossningslösning. Placera dem i inkubatorn i fem till 10 minuter och sedan bekräfta lossnar genom att titta på plattan under en brightfield mikroskop. När cellerna har lossnat, lägga till tumörcellmedia till plattan och överföra cellen suspensionen till en centrifug röret.

Snurra cellerna ner på 300 gånger g i fem minuter, ta bort supernatant, och återanvända cellerna i tumorsphere media. Efter resuspending cellerna, räkna dem med trypan blå och beräkna cellkoncentration. Platta rätt antal celler i en 96-väl låg-fästplatta och placera cellerna i inkubatorn fram till slutet av experimentet, var noga med att inte störa plattan om inte fylla på media.

Efter slutförandet av experimentet, identifiera tumörsfärer manuellt under ett ljusfält mikroskop eller med hjälp av Celigo programvara. Antalet och storleken på tumorspheres kan utvärderas som ett resultat av denna analys. För att förbereda tumorspheres för allograft transplantation, dra ihop alla tumorspheres erhållna från en specifik celltyp eller behandling.

Centrifugera tumörsfärerna och försiktigt ta bort supernatanten med en en-millimeters pipett följt av en 200-mikroliterpipett, tvätta dem sedan med 10 milliliter steril PBS. Snurra ner tumorspheresna igen och aspirera PBSEN. Tillsätt 500 mikroliter till en milliliter cellavlossningslösning ovanpå tumörsfärens pellet och inkubera cellerna i ett skakande vattenbad vid 37 grader Celsius.

Kontrollera progression av matsmältningen var 10 minuter. Hela processen gör tar upp till 30 minuter. Om matsmältningen av tumorsphere i skakning vattenbadet inte är tillräckligt för att erhålla en encellig lösning, mekanisk störning genom pipettering upp och ner föreslås.

Observera att efter spinning tumorspheres inte bildar en stabil pellet, så aspirera supernatanten bör göras noggrant med en en-milliliter pipetter och 200-mikroliter pipetter. När en encellig lösning erhålls, tillsätt en volym av tumörcellmedia och snurra ner den på 300 gånger g i fem minuter vid 4 grader Celsius. Efter denna centrifugering måste alla efterföljande steg utföras på is.

Resuspend cellerna i kalla tumör cell media och räkna levande celler med trypan blå uteslutning. Bestäm rätt antal celler för allograft och späd ut den i 50 mikroliter av kall tumör cell media. Placera en pipett spets i kall tumör cell media för att kyla den och sedan använda den för att ta 50 mikroliter av kall ECM-lösning och lägga till den i röret med celler, se till att inte ta bort ECM röret från is under denna process.

Underhåll cellerna på is tills transplantation och placera en utjämnad, 0,5-milliliter insulinspruta med en 29-gauge nål på is. Efter att ha bekräftat att musen har sövts på rätt sätt, rakar du djurets högra sida, aspirerar celllösningen i den kylda sprutan och injicerar cellerna subkutant i det rakade området. Om injektionen utförs korrekt kommer en synlig bula att bildas under huden.

Detta protokoll kan användas för att på ett tillförlitligt sätt bilda tumorspheres för identifiering av sällsynta cell populationer som är ansvariga för mjuk-vävnad sarkom utveckling. En grundläggande del av denna analys är diskriminering mellan tumorspheres och cellkluster, som uppvisar tydliga morfologiska skillnader. För att bestämma den optimala koncentrationen vid vilken ett protein av intresse utlöser en effekt på tumörceller, är det nödvändigt att bedöma nivån av uttryck av proteinet nedströms mål.

Tre av de testade generna visade ett dosberoende svar på rekombinant proteinbehandling och en gjorde det inte. För att upprätta ett effektivt protokoll, var effekterna av transfection på inneboende tumör celler analyseras;två olika mängder reagens testades och effektivitet bedömdes med en GFP-reporter plasmid. Lägre mängder reagens resulterade i högre transfektionseffektivitet.

Ett tvåstegsprotokoll måste implementeras för att utföra transfection på celler i suspension. Transfection utfördes på anhängare celler och 24 timmar senare var de lossnar och pläterade i suspension;efter sju dagar, var kontrollerade tumorspheres uttrycker GFP. Efter tumorspheres erhålls, behandlas, och transplanterade är det möjligt att jämföra effekten av denna olika behandling i tumörtillväxt in vivo.

Dessa metoder kommer att göra det möjligt för forskare att svara på de fortfarande stående frågorna om rhabdomyosarcomas ursprungscell och samtidigt lägga grunden för drogscreening.