用于隔离和测序微RNA并使用开源工具分析微RNA的完整管道

我们开发了一种定义、可重复和长期的协议，用于小型RNA测序和使用开源生物信息学工具分析规范化读取。我们战略的主要优点是，它通过凝胶纯化准确收集微RNA，无论微RNA如何收集，生物信息学分析都可以应用。微RNA的高通量测序可以揭示对疾病机制、微RNA处理以及提供小型RNA的基因治疗方法的准确定量。

确保在无 RNase 的环境中工作，并在整个过程中将所有RNA产品保持在冰上。可视化凝胶切割步骤将有助于查看者识别下游应用所需的产品的正确尺寸。对于三种原生适配器连接，将 11 微升 RNA 与 1.5 微升 ATP 无 ATP 10X T4RNA 连接酶反应缓冲液、1 微升聚乙烯二醇和 0.5 微升三个原成链接器。

在热循环器上加热样品在 95 摄氏度下 30 到 40 秒，然后在冰上冷却 1 分钟。加入一微升T4RNA连结酶2，在室温下孵育反应两小时。当样品孵育时，将15%聚丙烯酰胺凝胶倒入0.8毫米分离的玻璃板中，用塑料铸件插入梳子。

当凝胶凝固后，在罐中加入0.5 5X TBE，并大力清洗残留尿素的孔。在375伏特的预运行聚丙烯酰胺凝胶25分钟后，将样品加载，在每个样品之间至少留下一个通道。以不对称模式装载至少两组标记的 20 微升，以跟踪凝胶方向，并在恒定的 375 伏特下运行凝胶。

15 分钟后，在运行的其余部分增加至恒定的 425 伏特，并运行凝胶约两个小时。在运行结束时，使用板分离器将凝胶从玻璃板中去除，然后将凝胶放在塑料页保护器上。在500微升蒸馏水中稀释5微升溴化乙酰胺，并将染料添加到顶部浅蓝色标记上方的标记通道上。

接下来，使用干净的剃须刀刀片在紫外光下将每个通道的凝胶从上部切割到下部标记，然后将碎片转移到四到四厘米方的实验室密封膜中。水平切割约三个切口和两个切口，以产生 12 个小方块。在密封膜上加入 400 微升 0.3 摩尔氯化钠，并将凝胶片引导到 1.5 毫升硅化管中。

在四摄氏度下将样品在四摄氏度下搅拌。第二天早上，将每个上流液的400微升转移到新的管子中。每管加入1毫升100%乙醇和1微升15毫克甘油原共沉淀物。

然后在零下80摄氏度的温度下存放管子一小时。对于五个主要连接器连接，首先旋转解冻的样品，然后重新暂停水中的颗粒。接下来，在每个样品中加入0.5微升100微摩尔5个原极链接器、1微升T4RNA连结液缓冲液、10毫摩尔ATP微升和1微升聚乙烯二醇。

在90摄氏度下加热反应30秒，然后放在冰上。然后将一个微升的T4RNA连接到每个管中，并在室温下孵育反应两小时。对于逆转录，通过离心收集样品，并在8.25微升无核酸酶自由水中重新预支风干颗粒。

从互补的DNA合成试剂盒中加入0.5微升100微摩尔逆转录酶底转和5微升2X逆转录酶反应混合物。在42摄氏度下3分钟后，在每个样品中加入1.5微升10倍逆转录酶，在42摄氏度的热循环器中孵育30分钟。中和后， 用29.5微升水、5微升10X taq缓冲液、1微升核三磷酸盐、25微摩尔前底转微升、25微摩尔反向底土2微升、0.5微升塔克聚合酶和10微升反向转录补充DNA进行PCR反应。

然后运行两个 PCR 反应。对于阿加罗斯凝胶纯化，准备一个4%的加糖凝胶与低熔化的阿加罗斯和加载40微升或更多PCR产品到凝胶与加载染料和100基对和25基对大小标记。运行凝胶后，将带子切割到 125 基对带上方，然后根据制造商的说明使用凝胶提取套件。

在使用适当的设备量化最终序列库之前，在室温下摇动将凝胶带溶解在缓冲液中。然后使用适当的开源生物信息学工具分析序列数据。在这个具有代表性的PCR反应中，低熔糖凝胶，与获得的链接器链接器产品相比，可以观察到获得的正确克隆产品和不饱和样品。

与人类微RNA发夹对齐后，可以观察到每个复制的微RNA读取计数之间的强一致性。共检测到306个微RNA物种，其中对微RNA122的读取量最大。重要的是要记住，切割凝胶在适当的大小，使微RNA的准确恢复。

在对微RNA进行测序后，用户可以应用生物信息学分析来描述其感兴趣的组织内微RNA的分布特征。该技术已用于识别微RNA的处理方式，以及某些癌症中哪些微RNA被改变。在处理溴化乙基时和在紫外线下看凝胶时，请务必小心。