בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

מקרופאגים הקשורים לגידול ממלאים תפקידים חשובים במיקרו-וירוס הגידול. להבין כיצד מוטציות גנטיות שונות בתאי הגידול משפיעות על גיוס מקרופאג’ הוא קריטי לעיצוב טיפול מותאם אישית לחולי סרטן. מבחנה זו מספקת דרך קלה וחזקה להעריך את האינטראקציה בין תאים סרטניים מקרופאגים במבחנה.

ניתן לשנות את ההערכה הזו כדי להעריך את האינטראקציות בין תאי הגידול לתאי החיסון האחרים במבחנה. כדי להתחיל בהליך זה, לחמם את מדיום תא גזע ללא סרום על ידי הצבת אותו לתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לרסס את משטח מכסה המנוע של תרמת הרקמה עם 70% אתנול ולנגב את המשטח מרוסס עם מגבות נייר.

לאחר מכן לרסס את בקבוקי פתרון ניתוק בינוני ותא עם 70% אתנול ולנגב אותם עם מגבות נייר. מעבירים את הבקבוקים הנקיים למכסה המנוע של תרבות הרקמות. לאחזר את תא הגידול ולהעביר אותו למכסה המנוע של תרבות הרקמה.

שאפו את המדיום ושטפו את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של פתרון ניתוק התא לבקבוקון. מניחים את הבקבוקון במכסה המנוע, בודקים כל דקה כדי לראות אם תאי הגידול התעגלו.

לאחר שתאי הגידול מתעגלים, הקישו בעדינות על צד הבקבוק כדי לעזור לתאים להתנתק. לאחר מכן, פיפטה שמונה מיליליטר של תא ללא סרום בינוני לתוך הבקבוק פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לערבב. העבר את ההשעיה התאית הזאת לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

שאף את העל-טבעי. ואז לשטוף את התאים ב 10 מיליליטר של PBS, הקפדה פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

שאף את העל-טבעי, ולחץ מחדש על התאים ב-10 מיליליטר של מדיום נטול סרום. פיפטה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב. מערבבים 10 מיקרוליטרים של השעיית תא זה עם 10 מיקרוליטרים של פתרון טריפאן כחול.

הפיפסה הבאה 10 מיקרוליטרים של תערובת טריפאן כחול ותאים לתוך שקופית ספירה, ולהשתמש מונה תא אוטומטי לכמת את מספר התא החי. השתמש במדיום תאים ללא סרום כדי להתאים את צפיפות התאים לפי 2.5 10 לתאים החמישיים למיליליטר. ואז לזרוע שני מיליליטר של התאים לתוך כל באר של צלחת תרבות שש בארות.

במקביל, הכינו שש בארות עם שני מיליליטר בלבד של מדיום תאי גזע נטולי סרום. לאחר מכן, הדגירה את צלחות שש באר ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. ראשית לרסס את משטח מכסה המנוע של תרמת הרקמה עם 70% אתנול ולנגב את המשטח מרוסס עם מגבות נייר.

לאחר מכן לרסס את בקבוקי פתרון ניתוק בינוני ותא עם 70% אתנול ולנגב אותם עם מגבות נייר. מעבירים את הבקבוקים הנקיים למכסה המנוע של תרבות הרקמות. לאחר מכן, אחזר את לוחיות השש בארות מהחמה.

בזהירות pipette התקשורת מותנה לתוך 15 צינורות צנטריפוגה סטריליים מיליליטר, ולה מניחים את הצינורות על קרח. מוסיפים 0.5 מיליליטר של תותבת תאים לכל באר של צלחות שש הבאר, ובדקו כל דקה אם תאי הגידול מעוגלים. לאחר שתאי הגידול מתעגלים, הקישו בעדינות על צד הצלחת כדי לעזור לנתק את התאים.

הבא pipette 2.5 מיליליטר של תאים סרטניים תחזוקה בינוני לתוך הבאר פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים לערבב. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי באורך 15 מיליליטר. מערבבים 10 מיקרוליטרים של תאים עם 10 מיקרוליטרים של פתרון טריפאן כחול, ומעבירים 10 מיקרוליטרים של תערובת זו לשקופית הספירה.

השתמש מונה תאים אוטומטי לכמת את מספר התאים החיים, ולהשתמש באמצעי תא גזע ללא סרום כי היה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה כדי להתאים את נפח המדיה המותנית על פי מספר התא. סנן את המדיה המותנה באמצעות מסנני מיקרומטר של 0.45 והצב את המדיה המותנה בקרח. כדי להתחיל, לחמם את מדיום IMDM באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

נקה את מכסה המנוע של תרבות הרקמה עם 70%אתנול ונקה את בקבוק המדיום והעבר אותו למכסה המנוע כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן להעביר את הבקבוק של MV-4-11 תאים לתוך מכסה המנוע. פיפטה 10 מיליליטר של תאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.

השתמש ב- Trypan Blue וב מונה תאים אוטומטי כדי לכמת את מספר התאים החיים כפי שתואר קודם לכן. ואז צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים ב-10 מיליליטר של PBS.

צנטריפוגה שוב ב 200 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאפו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים במדיום IMDM בצפיפות תאים סופית של מיליון תאים למיליליטר. ראשית להביא את החומרים הדרושים לטמפרטורת החדר.

הוסף 250 מיקרוליטרים של תאי MV-4-11 המוכנים לכל הוספה. לאחר מכן להוסיף 400 microliters של מדיום מותנה או בינוני רק את התאים התחתונים של צלחת 24 באר, הקפד להוסיף את הדגימות ב triplicate. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות.

לאחר מכן הקישו בעדינות על ההוספה בקיר הפנימי של אותה באר והשליכו את ההוספה. בעדינות pipette התאים בארות למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לערבב. העבר 225 מיקרוליטרים של מתלי תא זה לתוך הבארות של צלחת 96 באר עם קיר שחור המתאימה למדידת פלואורסצנטי.

לאחר מכן, לדלל את הצבע CyQUANT עם חיץ תזה 4x ביחס של אחד עד 75. מערבולת בקצרה ולסובב את הפתרון. מעבירים 75 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל באר של צלחת 96 באר ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.

באמצעות קורא לוחיות פלואורסצנטיות, קרא את הפלואורסצנטיות ונתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, מים במבחנה משמש לחקר אינטראקציה מקרופאג הגידול. דגימות עם ערכי פלואורסצנטיות גבוהים מצביעות על כך שלמדיה המותנה יש יכולת גבוהה לגייס מקרופאגים.

בהתאם לצרכים הניסיוניים, ניתן לכלול פקדים נוספים. לדוגמה, ניתן להשתמש בנטרול נוגדנים כדי לטפל במדיה המותנה כדי לבטל את chemotaxis מקרופאג ולבצע באותו אופן. ניתן גם להוסיף כימוקינים נוספים למדיה המותנה, המשמשים כשליטה חיובית.

חשוב לשלוט בהבדלי מספר התאים עבור ההתדגם הזה מכיוון שסוגי תאים שונים יכולים לגדול במהירויות שונות. אישור Vivo של תוצאות במבחנה הם קריטיים. אפשר להזריק תאים סרטניים לעכברים ולנתח את הגידולים עם ציטומטריית זרימה, כשל חיסוני ו- CyTOF כדי לאשר את התוצאות.