Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.
Transcript
Dit protocol stelt ons in staat om axon begeleidingstrajecten actief in de oculomotorische zenuw te identificeren en om hun rollen te beoordelen op verschillende punten langs het zenuwtraject in real time. Deze techniek behoudt de lokale omgevingen waardoor axonen reizen en hun uiteindelijke doelen. De groeiende axonen worden niet gesneden, dus initiële axon uitgroei, in plaats van regeneratie, kan worden beoordeeld.
Deze methode geeft inzicht in axon begeleiding in het oculaire motorsysteem, maar kan worden aangepast aan de studie van axon begeleiding van andere zenuwen. Deze techniek neemt de praktijk onder de knie, en snel werken is uiterst belangrijk. Wanneer u het voor de eerste keer probeert, gebruik dan slechts een paar embryo's, in plaats van een heel nest.
Voordat u met de procedure begint, bevestigt u eerst de zwangerschap door echografie op embryonale dag 10,5 van een getimede paring. Oogst de embryo's, spray de buik van de zwangere muis met 70%ethanol en gebruik een schaar om de buikholte te openen om de baarmoeder te extraheren. Was de baarmoeder in een petrischaaltje ijskoud HBSS voordat u het orgel plaatst in een tweede petrischaaltje van verse ijskoude HBSS.
Verwijder onder een ontledend toepassingsgebied de embryo's uit de baarmoederhoorn en hun individuele vruchtzakjes en plaats elk embryo op de onderkant van het deksel van een 12-bronplaat, op ijs, terwijl ze worden geoogst. Gebruik filterpapier om elke vloeistof rond elk embryo te verwijderen, zonder de embryo's zelf aan te raken, en dompel de embryo's onder in vloeibare 4%laag smeltende agarose. Plaats het plaatdeksel op ijs om de agarose te stollen.
Wanneer de agarose is uitgehard, draai dan de embryo's om en bedek de andere kant van elk monster met extra agarose. Wanneer het tweede volume van agarose is gestold, gebruik dan een fluorescentie ontleden microscoop om de agarose trim rond elk embryo, zodat elk embryo goed zal worden georiënteerd op het vibratome stadium. De oculomotorische kernen en vroege axon uitwassen moeten fluorescerend zijn.
Lijn elk embryo zo uit dat de kern, ontgroeiende axonen en oogvorm een lijn vormen, en gebruik een scheermesje om de agarose parallel aan deze lijn te trimmen. Vul vervolgens de vibratomekamer met ijskoude plakbuffer en verlijm het eerste embryo naar het vibratome stadium, zodat het blad parallel loopt met de oculomotorische kern en ogen. Wanneer de superlijm droog is, dompelt u het vibratome-stadium onder, zodat het embryo is gericht op afstand van het blad, en gebruik een nieuw vibratomeblad om plakjes van 400 tot 450 micrometer te verkrijgen.
Gebruik een steriele overdracht pipet om elk plakje over te brengen in koude snijden buffer als het wordt verworven, en gebruik de fluorescentie ontleden microscoop om het segment met de oculomotorische kernen en ogen te selecteren. Met behulp van een steriele overdracht pipet, breng het segment op een cel cultuur invoegen in een zes-put plaat met 1,5 milliliter cultuur medium per put, en plaats de plaat in een 37-graden Celsius incubator. Verwijder de resterende agarose uit het vibratome stadium, en superlijm het volgende embryo op het podium, blijven plakken verzamelen totdat alle embryo's zijn geneuder en verguld.
Voeg vervolgens de juiste concentratie van de remmer of recombinant molecuul van belang, verdund in een geschikt oplosmiddel, toe aan het medium van elke put. Maak een dosisresponscurve. Beeld de plakjes om de 30 minuten door fasecontrast en fluorescentiemicroscopie voor maximaal 72 uur.
Tijdens de normale ontwikkeling van de utero bereiken de eerste groene fluorescerende eiwitpositieve oculomotorische axonen de baan per embryonale dag 11,5 voordat ze vertakken tot hun uiteindelijke doelen, zoals waargenomen in deze representatieve slicecultuur. De oriëntatie van het segment op de vibratome fase is van cruciaal belang, omdat de segmenten niet interpreteerbaar zijn als ze niet goed zijn georiënteerd. Als het embryo bijvoorbeeld naar zijn kant wordt gekanteld, wordt er slechts één oculomotorische kern waargenomen in het segment.
Als het ingebedde embryo te ver naar zijn rug wordt gekanteld, zullen de ogen niet aanwezig zijn in de slice, en in plaats daarvan kunnen de bovenste ledematen en achterheren of het ruggenmerg worden opgenomen. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat tijdens de plaatsing van het plakje op het cultuurmembraan, dat het weefsel niet wordt gevouwen. Let op bij het oplossen van de remmers en groeifactoren in organische oplosmiddelen.
Bijvoorbeeld, in dit experiment, de slice stierf na de toevoeging van ethanol aan het medium. Vergeet niet om alles op ijs te houden en de tijd tussen de extractie van de embryo's en het plaatsen van de plakjes in de couveuse te minimaliseren. Met behulp van deze techniek zijn we begonnen met het identificeren van extra axon geleidingsmechanismen op het werk in het oculaire motorsysteem.
Vergeet niet voorzichtig te zijn bij het werken met scheermesjes en dat sommige remmers gevaarlijk kunnen zijn en zorgvuldig moeten worden behandeld volgens hun veiligheidsprofielen.
Tags
Neuroscience Oculomotor aangeboren craniale dysinnervatie stoornis axon-geleiding oogbewegingen timelapse-beeldvorming segment cultuurRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
