Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunforeleggelse i tandem etterfulgt av sekvensering, eller RIPiT-Seq, er en metode for å identifisere hvilke regioner av RNA som er bundet av et bestemt par RNA bindende proteiner. Den mest unike fordelen med RIPiT er dens evne til å målrette to forskjellige proteiner i to renser. Dette gir en kraftig måte å berike for et kompositorisk distinkt RNA-proteinkompleks fra andre komplekser.

RiPiT-Seq er også UV-kryssbinding uavhengig, og kan brukes på mange proteiner som virker på RNA uten å binde den direkte. Selv om denne metoden ikke strekker seg direkte mot terapi eller diagnose, har RNA bindende proteiner og RNA-behandling vært forbundet med flere sykdommer som nevropatier og kreft. RIPiT-Seq gir et verktøy for å studere funksjoner av sykdomsrelaterte RNA bindende proteiner.

RIPiT-Seq krever et system der et epitop-merket protein kan uttrykkes. Det har bare blitt testet i HEK293 celler, og er mest mottagelig for cellekultur. Men nå med vår evne til å tagge proteiner ved hjelp av CRISPR, kan RIPiT-Seq gjelde for ulike moderne systemer.

Suksessen til RIPiT avhenger av to effektive immunforekomst, så det vil være avgjørende å optimalisere immunforekomstforholdene for antistoffet som brukes. Også arbeid med RNA krever riktige forholdsregler, så RNase-frie reagenser bør brukes under og etter RNA-ekstraksjon. Å demonstrere prosedyren vil være Lauren Woodward, en utdannet student i laboratoriet mitt.

Start med å vaske monolayer celler forsiktig med 15 milliliter kjølt PBS per 15 centimeter plate. Skrap deretter av celler i 30 milliliter PBS og samle dem i et 50 milliliter konisk rør. Pellet cellene ved å sentrifugere ved 400 g i 10 minutter ved 4 grader Celsius, og kast det overnaturlige.

Tilsett fire milliliter iskald hypotonisk lysisbuffer og bruk en P1000-pipette til å suspendere cellene på nytt. Overfør lysatet til et fem milliliter rør og inkuber på is i 10 minutter. Plasser lysate i et isbad og sonikere i henhold til manuskriptretninger.

Tilsett deretter 108 mikroliter med fem molarnatriumklorid for å justere saltkonsentrasjonen til 150 millimolar. Deretter sentrifugere lysatet på 12,000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og samle 20 mikroliter av supernatant for vestlig flekk analyse. Pre-vask FLAG agarose perler i henhold til manuskript retninger og bruke gjenværende supernatant til 750 mikroliter perler i en fem milliliter tube.

Inkuber FLAG agarose perler med celleekstraktet i en til tre timer ved fire grader Celsius med mild blanding. Etter inkubasjon, pellet perlene ved sentrifugering på 400 g i ett minutt ved fire grader Celsius, og samle 20 mikroliter av supernatant for vestlig flekk analyse. Kast de resterende supernatante og vask perlene ved å bruke dem på fire milliliter iso vaskbuffer.

Pellet perlene igjen og fjern supernatant. Fortynn RNase I i 750 mikroliter iso vaskbuffer i henhold til manuskriptretninger, og legg den til FLAG agarose perler. Inkuber blandingen ved fire grader Celsius med mild blanding, og pellet deretter perlene ved sentrifugering.

Samle 20 mikroliter supernatant for vestlig flekkanalyse, og kast resten. Vask deretter perlene med iso vaskebuffer som tidligere beskrevet. Deretter utfører du affinitetsution ved å legge til 375 mikroliter elutionbuffer til perlene, og riste blandingen forsiktig ved fire grader Celsius i en til to timer.

Etter inkubasjon, pellet perlene og samle en 15 mikroliter aliquot av elution for vestlig flekk analyse. Mens affinitet elution er i gang, utføre magnetisk perle antistoff bøyning. Begynn med å vaske 50 mikroliter magnetiske perler i en milliliter iso vaskbuffer.

Resuspend perlene i 100 mikroliter konjugeringsbuffer og legg til riktig mengde antistoff. Deretter inkuber perlene i minst 10 minutter ved romtemperatur. Vask de magnetiske perlene to ganger med bøyningsbuffer og resuspend perlene i 375 mikroliter ripit fortynningsbuffer.

Oppbevar perlene på is til immunforutståelse. Påfør FLAG affinitet elution til antistoff-skrevet magnetiske perler og inkubere med mild blanding i en til to timer ved fire grader Celsius. Fang de magnetiske perlene med en magnet og samle 15 mikroliter supernatant for vestlig flekkanalyse.

Vask deretter perlene syv ganger med iso vaskbuffer. Fortsett med denaturing elution ved å gjenopplive magnetiske perler i 100 mikroliter klar prøvebuffer og inkubere suspensjonen på is i 10 minutter. Under inkubasjon, knips regelmessig perlene for å gjenopplive dem.

Fang de magnetiske perlene på en magnet og samle 15 mikroliter av elution for vestlig flekkanalyse. Overfør resten av eliminasjonen til et nytt 1,5 milliliter rør. For å trekke ut RNA, tilsett 320 mikroliter RNase-fritt vann og 400 mikroliter fenolklorform isoamylalkohol til RIPiT-elutionen.

Vortex blandingen og sentrifuger den på 12.000 g i fem minutter. Samle 350 mikroliter av vandig fase i et eget rør. Tilsett natriumacetat, magnesiumklorid, glykogen og etanol til den oppsamlede prøven og inkuber blandingen over natten ved negative 20 grader Celsius.

På neste dag, pellet RNA ved sentrifugering på 12,000 g i 30 minutter ved fire grader Celsius og vaske den i 70% etanol. Etter etanolvasken, behandle RNA med T4 polynukleotid kinase, eller PNK, uten ATP, og utføre fenol-kloroform rensing i henhold til manuskript retninger. Bruk den rene RNA i 4,5 mikroliter rnasefritt vann.

For å kvantifisere RNA-utbyttet, må RNA med PNK og 32P-merkede ATPer kvantifisere RNA-utbyttet. Bruk en DNA-stige med lavt område og en 20 til 40 nukleotid syntetisk oligo for størrelses- og mengdestandarder. Løs merket RNA på en 26% urea-polyakrylamidgel.

Tørk gelen i henhold til manuskriptets retninger og utsett gelen for et fosfoscreen til tilstrekkelig signal oppdages. Denne teknikken har blitt brukt til å undersøke interaksjonene til exon junction kompleks eller EJC. Vestlig flekkanalyse av proteiner renset fra hvert hovedtrinn i RIPiT-prosedyren viser at renset EJC inneholder både EIF4A3 og MAGOH.

Den negative kontrollen, HNRNPA1, oppdages ikke i elution. Styrken av RNA fotavtrykk signal korrelerer med mengden av RNA protein interaksjon. Et sterkere fotavtrykk observeres når RIPiT ble utført på celler behandlet med puromycin, noe som øker EJC-belegget på RNA.

For å sikre at RIPiT har vært effektiv, er det viktig å teste effektiviteten til IP av vestlige blot. Det er også viktig å vurdere mengden og kvaliteten på RNA før du fortsetter med dyp sekvensering. I 2018 brukte Singh-laboratoriet denne teknikken til å rense to kompositoriske forskjellige varianter av exon-koblingskomplekset og identifisere RNA-bindingsmønstre.

Hvis forskere velger å oppdage RNA-fotavtrykk med autoradiografi, bør alle riktige strålingssikkerhetsprosedyrer og protokoller følges.