A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade
Chapters
Summary February 15th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.
Transcript
Hallo allemaal, mijn naam is Dr. Bipasha Bose. Ik werk als universitair hoofddocent en verantwoordelijk voor het Stem Cells and Reerative Medicine Center, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, India. Nu gaan we laten zien hoe te detecteren voor de aanwezigheid voor ROS dat wil zeggen, reactieve zuurstof soorten "in de levende culturen van de muis oculaire oppervlakken die zijn blootgesteld aan verschillende doses van ultraviolet-C straling.
Het voordeel van deze techniek is dat we hier tegelijkertijd kunnen detecteren op de aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten, levende en dode cellen, zonder dat we Vester cellen hoeven te hebben. Het principe van deze techniek ligt in wezen in de levende cel doorlaatbaarheid van de kleurstof DCFDA. DCFDA is een levende cel permeant kleurloze kleurstof, die tijdens oxidatieve stress wordt gehandeld door de intracellulaire oxidases en wordt omgezet in groene fluorescerende DCF.
Vandaar dat de groene florescentie ons in staat stelt om de aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten in de levende cellen op te sporen. Aan de andere kant, propidium jodide is een uitsluitend dode cel permeant kleurstof die fluoresceren rood. Het is een rDNA dubbelstrengde intercalating kleurstof.
Echter, de kleurstof Hoechst is permeant aan zowel de levende en dode cellen. Het is een blauwe kleur nucleaire vlek. Vandaar, dit is een zeer eenvoudige methode waarbij we kunnen detecteren voor de aanwezigheid van reactieve zuurstof soorten in lange termijn culturen in een tijd afhankelijke manier, samen met de beoordeling van dode cellen.
Plaatpunt twee miljoen cellen per 35 millimeter kweekschotels. De cellen die we toepassen zijn de cellen van het muizenoculair oppervlak. Verwijder het maximale volume van de media uit elk van de celkweek gerechten.
Laat ongeveer 500 microliters van celkweekmedia achter in nauw contact met de cellen. Minimale hoeveelheid media zal het drogen van de cellen voorkomen. Echter, het doel van minimale hoeveelheid media is om de maximale penetratie van UVC blootstelling mogelijk te maken.
Neem de cellen onder een UV-bron, het kan ofwel een UV Crosslinker, of kan een andere ultraviolet-C bron. Stel de cellen bloot aan verschillende dosering UVC-straling, zoals een, 10, 100, 1, 000 en 10.000 joules per vierkante meter. Wanneer de cellen zijn blootgesteld aan ultraviolet-C straling, moeten de deksels in de open positie.
Dit zal een maximale penetratie van de ultraviolet-C naar de cellen mogelijk maken en dus de optimale dosisrespons van de cellen op de ultraviolet-C-straling weergeven. Breng de cellen naar de laminaire luchtstroom kap en vul elk van de gerechten met twee milliliter van complete media. Deze volledige media bevat 20%foetale runderserum in DMEM, aangevuld met supplementen zoals 1%minimaal niet-essentiële aminozuren, en ook 1%antibioticum dat penicilline en streptomycine is.
Daarna, na het aanvullen met maximaal volume, dat is twee milliliter van volledige media, terug te keren naar de incubator en incubeer voor een periode van drie uur om vroege effecten van ultraviolet-C straling te zien. Bereid de live cel kleuring media in de laatste 15 minuten van drie uur na UVC cel incubatie. Kleuring media wordt bereid in 10%FBS met DMEM voorverwarmd tot 37 graden.
Voor het maken van 10 milliliter kleuring media, eerst vijf microliter dcfda toe te voegen uit een voorraad van 10 millimolar om een definitieve concentratie van vijf micromolar te verkrijgen. Meng goed door pipetting op en neer. Ten tweede, voeg vijf microliter Hoechst oplossing uit een voorraad van 10 milligram per mL om een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per mL te verkrijgen.
Nu goed mengen door pipetting op en neer. Voeg ten slotte 200 microliter propidiumjodide toe uit een bestand van één milligram per mL om een uiteindelijke concentratie van 20 microgram per mL te verkrijgen. Meng goed door pipetting op en neer.
Nu is de kleuroplossing klaar voor gebruik. Na drie uur incubatie na blootstelling aan UVC, verwijder de platen uit de CO2-incubator. Aspirate uit de media van elk van de gerechten die zijn blootgesteld aan verschillende dosering van UVC, zoals een, 10, 100, 1, 000, en 10, 000 joules per vierkante meter.
Voeg nu twee milliliter vers bereide live cel kleuring media aan elk van de gerechten voorzichtig vanaf de zijkanten van de gerechten. Breng de platen weer terug naar de CO2-incubator en broed gedurende 15 minuten in voor levende celvlekken. Na 15 minuten van incubatie in de levende cel kleuring media, verwijder de kleuring media van elk van de gerechten met cellen blootgesteld aan verschillende doses ultraviolet-C straling.
Vul de cellen aan met twee milliliter volledige media. Nu zijn de cellen klaar om te bekijken. Plaats nu de controlecellen onder het heldere veld van de fluorescerende imager.
De cellen zien er blijkbaar normaal, omdat ze controlecellen. Onder het blauwe veld kunnen we de fluorescerende totale cellen. Onder het groene veld toont de ROS generatie.
Aangezien dit controlecellen zijn, is er geen ROS gegenereerd. Onder het rode veld zijn de propidium jodide gekleurde dode cellen zichtbaar. Houd vervolgens de UV blootgesteld 100 joules per meter vierkant onder het heldere veld.
Onder het blauwe veld, en ook kunnen we het totale celnummer onder het blauwe veld zien. Echter, wanneer we blootstellen aan groen veld, DCFDA positieve cellen worden gezien, en ook PI positieve dode cellen worden gezien. Ten slotte, plaats de maximale UV-dosis, dat is 10.000 joules per meter vierkante blootgestelde cellen, onder het heldere veld.
We kunnen abnormale celmorfologie zien. Echter, onder het blauwe veld kunnen we zien totale blauwe cellen. Onder het groene veld worden groene fluorescerende DCFDA-positieve cellen gezien die de ROS-generatie aangeven.
Wanneer de cellen worden blootgesteld aan rood veld, alle cellen waren fluorescerende rood aangeeft een groot aantal celdood wanneer de cellen worden behandeld met 10.000 joules per meter vierkant van UV-dosering. Schik nu de beelden die in verschillende kanalen zijn vastgelegd in een enkel samengesteld beeldpaneel dat overeenkomt met de ultraviolette-C-doses en onbelichte besturingselementen. De afbeeldingen zijn gerangschikt in één paneel in groep.
Ten eerste, het heldere veld. Ten tweede, de Hoechst blauwe nucleaire vlek. Ten derde, propidium jodide kleuring als voor dode kernen.
Ten vierde, DCFDA voor ROS positieve cellen. En ten vijfde, het samengevoegde beeld. Als we kijken naar de eerste en de tweede rij beelden, dat is onbelichte controle en de cellen blootgesteld aan de UVC dosis een joule per meter vierkant, merkten we op dat er noch PI noch ROS positieve cellen die was verlicht, waardoor een volledige afwezigheid van ROS en celdood in onbelichte controles en zo'n lage UVC dosis van een joule per meter plein.
Nu komt naar de derde rij van samengestelde beelden van de cellen die werden blootgesteld aan 100 joules per meter vierkant. Een zeer laag percentage cellen, ongeveer 10% waren positief voor zowel PI en DCFDA bij deze dosis, wat wijst op een lage hoeveelheid ROS-generatie en celdood. Nu gaan we over op een verdere hogere dosis UVC-blootstelling aan straling, dat is 1.000 joules per vierkante meter, zoals aangegeven in de vierde rij van het samengestelde beeld.
Hier was ongeveer 70% van de cellen positief voor PI en DCFDA. Ten slotte gaan we over op de hoogste dosis UVC-belichting, dat is 10.000 joules per vierkante meter, zoals weergegeven in de vijfde rij van het samengestelde beeld. Hier waren vinden dat bijna 100% van de cellen positief waren voor zowel PI en DCFDA, wat wijst op een 100% cel dood en ROS generatie op deze specifieke UVC dosis.
Breng de beelden over naar de beeldsoftware. Open eerst de blauwe afbeelding die de door Hoescht gekleurde kernen aangeeft, dat is het totale aantal cellen. Open het telgereedschap en klik op elk van de cellen een voor een om het nummer te hebben.
Open nu het beeld dat is vastgelegd onder het rode kanaal met vermelding van de PI-positieve dode cellen. Open het telgereedschap en klik op elk van de rode vlekken die de telling voor de PI-positieve dode cellen aangeven. Zodra het tellen van de dode cellen voorbij is, klikt u op het groene kanaal gevangen cellen en open het telgereedschap en klik op elk van de groene vlekken met vermelding van de cellen met de ROS-generatie.
Voltooi het tellen van de groene cellen die onder het groene kanaal zijn opgevangen en schrijf vervolgens het percentage celdood op door UVC-schade en percentage van de ROS-productie door UVC-schade. Dit wordt berekend met behulp van het eenvoudige formulenummer van PI-positieve cellen, dat wil zeggen de rode fluorescerende cellen, gedeeld door het aantal Positieve Hoechstcellen vermenigvuldigd met 100. Percentage ros-productie door UV-schade wordt berekend aan de hand van de formule, het aantal DCFDA-positieve of groene fluorescerende cellen, gedeeld door het aantal positieve Hoechst-cellen vermenigvuldigd met 100.
Zodra u beide percentages hebt, dat is percentage van celdood en het percentage rosproductie, gebruikt u deze waarden om een staafgrafiek in kaart te brengen. X-as geeft de dosering van UV aan, terwijl y-as het percentage cellen aangeeft. De groene balken geven het percentage ROS-generatie aan, terwijl de rode balk het percentage celdood aangeeft.
Na analyse, is het duidelijk dat bij UVC dosis 100 joules is er 10%ROS genererende cel evenals een 10%cel dood. Terwijl bij de UVC dosis 10 verhoogd tot drie joules per meter vierkant, 70%-cellen vertonen ROS generatie evenals celdood. Terwijl bij de hoogste dosis UVC, dat is 10 verhoogd tot vier joules per meter vierkant, ongeveer 100% cellen tentoongesteld celdood evenals ROS productie.
Vandaar, kan worden geconcludeerd dat er een sterke positieve correlatie tussen de ROS generatie en celdood. Tot slot, deze techniek is erg handig voor gelijktijdige beoordeling van reactieve zuurstofsoorten, levende en dode cellen in levende, normale gebeurteniscultuur. Deze techniek is ook nuttig voor een beperkte beoordeling van reactieve zuurstofsoorten, levende en dode cellen, in langdurige culturen die zijn blootgesteld aan verschillende celbeschadigende stoffen zoals ultraviolette straling, of chemische agentia.
En deze techniek kan ook een onderzoeker begeleiden voor het bepalen van de optimale tijd voor het oogsten van de cellen zoals bij 50%ROS, 75%ROS, enzovoort, want er kan veel downstream toepassingen zijn, zoals QR naar PCR en Western blotting.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
