Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Introduktion af et gen knockout direkte i den Amastigote fase af Trypanosoma cruzi ved hjælp af Crispr/Cas9 system
Chapters
Summary July 31st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en protokol til at introducere en gen knockout i den ekstracellulære amastigote af Trypanosoma cruzi, ved hjælp af crispr/Cas9 system. Væksten fænotype kan følges op enten ved celletælling af axeniske amastigote kultur eller ved spredning af intracellulære amastigotes efter vært celle invasion.
Transcript
Det er svært at bruge værten infektion fase af T.cruzi i eksperimenter, fordi amastigote er en forpligte intracellulære parasit. Vores dyrkningsteknik gør det muligt for amastigote midlertidigt at replikere uden for værtscellen, så vi kan udføre eksperimenter direkte på denne klinisk relevante fase af parasitten. Demonstration af proceduren vil være Yukie Akutsu, en tekniker fra vores institut.
Opretholde en vært parasit co-kultur i henhold til manuskriptet retninger. Når Cas9-udtryk parasitten er klar til differentiering, indsamle supernatant i et konisk rør, og kontrollere for prøven kvalitet under et mikroskop. Hvis der er et betydeligt antal ekstracellulære amastigotes, udføre en swim-out procedure for at isolere trypomastigotes.
Spin ned blandingen af trypomastigotes og amastigotes i femten minutter som 2, 100 gange G.Derefter kassere det meste af supernatant, forlader 0,5 til 1 milliliter medium i røret. Hætten af røret løst, og inkuber pellet ved 37 grader Celsius i en til to timer, hvilket vil gøre det muligt for de aktive trypomastigotes at svømme ud af pellet. Efter inkubationen overføres supernatanten med trypomastigotes til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.
Spin det ned, og resuspend pellet med 5 milliliter DMEM. Parasitten overføres til en T-25-kulærkolbe, og kolben inkuberes ved 37 grader Celsius under 5 % kuldioxid i en befugtet inkubator. Omkring 95% af parasitterne vil differentiere sig i amastigotes efter 24 timer.
Centrifuge kulturen af ekstracellulære amastigotes i 15 minutter ved 2, 100 gange G, og kassér supernatant. Pelletsuspendrer pellet med elektroporationsbuffer, der indeholder den medfølgende supplementopløsning til en endelig celletæthed på en gang 10 til 8. Aliquot 100 mikroliter af de resuspenderede parasitter i 1,5 liters mikrocentrifuge rør.
Derefter tilsættes fem til 10 mikrogram Guide RNA, og bland forsigtigt ved pipettering. Overfør blandingen til en to millimeter hul elektroporation cuvette, og anvende en puls med elektroporation enhed. Cuvetteindholdet overføres derefter til en T-25-kolbe, der indeholder fem milliliter forvarmet LIT-medium, lad hætten være løs, og kolben inkuberes ved 37 grader Celsius under 5 %kuldioxid.
Overvåge cellevæksten enten ved fortsættelse af aksenisk dyrkning eller som intracellulære amastigotter efter værtscelleinfektion. Hvis cellevæksten overvåges som aksetniske amastigotes, rystes kolben forsigtigt for at opbruge de ekstracellulære amastigotter i opløsningen og blandes 20 mikroliter af kulturen med en mikroliter propidiumdodidopløsning i et mikrocentrifugerør. Det er vigtigt ikke at lade kulingskolben være uden for inkubatoren i længere tid end nødvendigt, fordi temperaturen er en af de faktorer, der muliggør amastigote- spredning af amastigter.
Påfør prøven på et hæmocytometer, og observere det under en fluorescens mikroskop. Derefter tælle antallet af levedygtige amastigotes, der ikke er plettet af propidium iodid. For at overvåge væksten af knockout celler som intracellulære amastigotes, frø vært 3T3 celler i en 12-brønd plade med DMEM.
En dag efter elektroporation indsamle knockout amastigotes ved centrifugering, kassere supernatant, og resuspend parasitter med to milliliter DMEM. Fjern mediet fra værtscellekulturen, og tilføj de resuspenderede amastigotes. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid i to dage, hvilket vil gøre det muligt for amastigotes at etablere en infektion.
Efter de to dage, vaske væk ekstracellulære amastigotes uden for værtsceller med DMEM, og tilsæt frisk DMEM. Fortsæt inkubationen i yderligere to dage, og visualiser derefter kernen i værtscellerne og de intracellulære amastigotter. Det er blevet påvist, at T.Cruzi amastigotes transfekteret med Guide RNA mod det væsentlige gen TcCGM1 viser en betydelig vækstdefekt sammenlignet med en kontrolgruppe.
Ved overvågning af vækst som intracellulære amastigotes er den andel af værtskerner, der er forbundet med T.Cruzi-kerner, signifikant lavere i TcCGM1 knockout-gruppen sammenlignet med kontrollen. Tværtimod påvirker transinfektion af Guide RNA mod et af paraflagellar rodproteinerne TcPAR1 ikke cellevæksten væsentligt efter fire dages aksenisk dyrkning eller hæmmer væksten af intracellulære amastigoter. Men, fem dage efter infektion, antallet af trypomastigotes, der dukker op ud af værtscellen er betydeligt lavere i TcPAR1 knockout co-kultur i forhold til kontrol co-kultur.
Desuden syntes de differentierede trypomastigotes inde i værtscellen i kontrolgruppen mere aktive end dem i udskæringsgruppen. Denne metode kan også bruges til at undersøge virkningerne af udefrakommende gener på amastigote fase i stedet for transfecting Guide RNA i Cas9-udtryk amastigote, kan du transfect plasmid i en vild-type amastigote at udtrykke en udefrakommende gen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
