Immunology and Infection
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Lentiviral CRISPR/Cas9介导基因组编辑，用于疾病模型中造血细胞的研究
Chapters
Summary October 3rd, 2019
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本文介绍了CRISPR/Cas9系统对鼠血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的协议，以快速开发具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。
Transcript
我们开发了一种高效、经济的方法，利用基因组编辑技术和扁病毒介质的转基因传递系统，专门利用造血干细胞中的基因操作建立小鼠。与传统小鼠转基因方法相比，此协议的优点在于，我们可以创建动物模型，以快速且具有成本效益的方式在造血细胞中携带特定突变。演示这个程序的将是王英，一个来自我实验室的研究员。
要产生扁病毒颗粒，首先用胶原蛋白溶液编码六井板，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育30分钟。然后，将293T细胞种子放在盘子上，再孵育两个小时。同时，通过结合0.9微克的扁病毒载体、0.6微克的psPAX2和0.3微克的pMD2，准备三种转染质粒的混合物。
G 和除去到每井 10 微升。然后，小心地将50微升1X PBS和5微升稀释PEI MAX加入质粒混合物中，并在室温下孵育混合物15分钟。孵育后，加入一毫升DMEM。
从六井板中吸出介质，并在每井中加入一毫升质粒混合物。再孵育三个小时的盘子。用新鲜的 DMEM 更换介质，孵育 24 小时。
加入一毫升新鲜DMEM，再孵育24小时。总共48小时后，将上经液转移到50毫升管中，并在3000次G下离心15分钟，以去除任何自由漂浮的细胞。通过 0.45 微米过滤器过滤上清液，然后超离心机 3 小时。
小心吸上清液，留下白色颗粒。用100微升无血清造血细胞扩张介质重新悬浮颗粒，无需气化。保持10微升等分，测量病毒滴度，并储存在零下80摄氏度的悬浮液的其余部分，直到准备使用。
隔离骨骼后，将它们放入带 RPMI 的 50 毫升锥形管中，然后将管子放在冰上。在生物安全柜中，将骨骼转移到无菌的100毫米培养皿中。然后用钝钳抓住骨头，用解剖剪刀小心切开两个表皮。
用冰冷 RPMI 填充 10 毫升注射器，并使用 22 量针将骨髓从轴冲洗到新的 100 毫米培养盘中。收集所有骨髓后，通过10毫升注射器用18针将骨髓通过，使单个细胞悬浮。通过 70 微米细胞滤株将悬浮液过滤到 50 毫升锥形管中。
然后根据手稿方向离心管，吸上一代。在适当体积的优化分离缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。要分离血统阴性细胞，请根据制造商的说明使用血统细胞损耗套件。
在无血清造血细胞扩张介质中重新悬浮分离的血统性阴性细胞。在37摄氏度的二氧化碳中预孵育细胞两小时。然后根据手稿说明添加扁病毒，并将细胞留在培养箱中再进行 16 到 20 小时。
第二天，在15毫升锥形管中收集扁病毒转换细胞，并在300倍G下离心10分钟。根据 NHA 指南，在里斯组二级处理扁病毒载体非常重要。必须根据设施法规采取预防措施。
小心吸升液，每只鼠标在 200 微升 RPMI 中重新悬浮颗粒。将细胞保持室温，直到移植到小鼠体内。在第二次照射后，使用胰岛素注射器将转导脱线阴性细胞注射到每只麻醉小鼠体内。
骨髓移植后三到四周，使用毛细管从逆轨道静脉获取血液样本。将20微升血液转移到圆底聚苯乙烯试管中，放在冰上。RBC解解后，在黑暗中用单克隆抗体的鸡尾酒孵育细胞，在室温下孵育20分钟。
孵育后，清洗、固定和离心细胞，并在400微升的FACS缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。将样品保持在四摄氏度，直到通过流式细胞分析。通过RFP的流式细胞测量检测，可以评价血统负细胞转导的成功。
已经证明，经过7天的体外培养，平均75.7%的细胞被转导。流细胞学还用于分析小鼠外周血后重组与转导和非转导造血干细胞。平均94.8%的嗜中性粒细胞、93.5%的单核细胞和82.7%的B细胞表达RFP。
来自RFP阳性血细胞的基因组DNA已被PCR扩增和亚克隆用于序列分析。检测到各种突变，69% 的克隆显示出帧或过早停止突变。为了成功完成这一程序，需要为造血细胞的转导和移植准备高杀毒药物和优化条件。
我们运用这一技术研究心血管疾病的规律。但它也是有用的研究血液恶性肿瘤。该方法使我们能够高效、高效地研究造血系统中新型基因的功能。
我们收集这一点，对转基因小鼠的可用性。
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