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설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.
우리는 조혈 줄기 세포에서 특히 유전자 조작으로 마우스를 확립하는 효율적이고 경제적인 방법을 개발했습니다, 게놈 편집 기술과 렌즈바이러스 매개 트랜스진 전달 시스템을 사용하여. 이 프로토콜의 장점은 기존의 마우스 형질 전환 접근법에 비해 신속하고 비용 효율적인 방식으로 조혈 세포에서 특정 돌연변이를 수용하는 동물 모델을 만들 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 잉 왕, 내 실험실에서 연구원이 될 것입니다.
렌티바이러스 입자를 생성하려면 콜라겐 용액으로 6개의 웰 플레이트를 코딩하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음, 293T 세포를 접시에 넣고 또 다른 2시간 동안 배양한다. 한편, 렌티바이러스 벡터0.9 마이크로그램, psPAX20.6 마이크로그램 및 pMD20.3 마이크로그램을 결합하여 3개의 트랜스펙트 플라스미드의 혼합물을 준비한다.
G와 잘 당 10 마이크로 리터로 디온화. 이어서, 1X PBS 50마이크로리터와 희석된 PEI MAX 5마이크로리터를 플라스미드 혼합물에 조심스럽게 추가하고, 15분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 인큐베이션 후 DMEM의 밀리리터 1개를 추가합니다.
6 개의 우물 플레이트에서 미디어를 흡인하고 각 우물에 플라스미드 혼합물 1 밀리리터를 추가합니다. 접시를 3시간 더 배양합니다. 미디어를 신선한 DMEM으로 교체하고 24시간 동안 배양합니다.
신선한 DMEM 1밀리리터를 추가하고 24시간 추가로 배양합니다. 총 48시간 인큐베이션 후, 상체관을 50밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 15분 동안 3000회 G로 이송하여 자유 부동 세포를 제거합니다. 0.45 마이크로미터 필터와 초원심분리기를 3시간 동안 필터링합니다.
조심스럽게 상류체를 흡인하고 흰색 펠릿을 남깁니다. 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 배지의 100 마이크로리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 10 마이크로리터 알리쿼터를 보관하여 바이러스 성 티터를 측정하고 나머지 현탁액을 영하 80°C에 보관하십시오.
뼈를 격리한 후 RPMI가 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 바이오 안전 캐비닛에서 뼈를 멸균 100mm 배양 접시로 옮킨다. 그런 다음 무딘 집게로 뼈를 잡고 해부 가위를 사용하여 두 epiphyss를 조심스럽게 자른다.
얼음 차가운 RPMI로 10 밀리리터 주사기를 채우고 22 게이지 바늘을 사용하여 샤프트에서 골수를 새로운 100mm 배양 접시로 플러시합니다. 모든 골수가 수집 된 후, 18 게이지 바늘로 10 밀리리터 주사기를 통해 골수를 통과하여 단일 세포 현탁액을 합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 셀 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 필터링합니다.
그런 다음 원고 의 지시에 따라 튜브를 원심 분리하고 슈퍼 나티튜트와 흡인합니다. 최적화된 분리 버퍼의 적절한 부피로 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 계보 음성 세포를 격리하려면 제조업체의 지침에 따라 계보 세포 고갈 키트를 사용하십시오.
혈청이 없는 조혈 세포 팽창 배지에서 격리된 계보 음성 세포를 다시 중단한다. 2시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도의 세포에 사전 배양합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 렌즈바이러스를 추가하고 다른 16 ~ 20 시간 동안 인큐베이터에 세포를 둡니다.
다음 날, 15 밀리리터 원추형 튜브에서 렌티바이러스 변환 된 세포를 수집하고 10 분 동안 300 배 G에서 원심 분리합니다. NHA 지침에 따르면, 리스 그룹 레벨 2에서 렌티 바이러스 벡터를 처리하는 것이 중요합니다. 시설 규정에 따라 주의사항을 취해야 합니다.
조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 마우스 당 RPMI의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 생쥐로 이식될 때까지 세포를 실온에서 유지하십시오. 두 번째 조사 세션 후, 레트로 궤도는 인슐린 주사기를 사용하여 각 마취 마우스에 추론 된 네거티브 세포를 주입합니다.
골수 이식 후 3~4주 후에 모세관 튜브를 사용하여 레트로 궤도 정맥에서 혈액 샘플을 채취한다. 혈액 20 마이크로리터를 둥근 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. RBC 용해 후, 실온에서 20 분 동안 어둠 속에서 단일 클론 항체의 칵테일로 세포를 배양하십시오.
인큐베이션 후, 세척, 수정 및 원심분리및 FACS 버퍼의 400 마이크로리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 혈중 세포측정에 의한 분석이 될 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 유지합니다. 리니지 음성 세포 변환의 성공은 RFP의 유동 세포 측정 검출으로 평가될 수 있다.
체외 배양 7일 후, 평균적으로 세포의 75.7%가 전염된다는 것이 입증되었습니다. 유동 세포질은 또한 변환및 비유도 조혈 줄기 세포로 재구성 한 후 마우스 말초 혈액을 분석하는 데 사용되었습니다. 호중구의 평균 94.8%, 단핵구의 93.5%, B 세포의 82.7%가 RFP를 발현한다.
RFP 양성 혈액 세포로부터의 유전체 DNA는 서열 분석을 위해 PCR 증폭 및 하위 복제되었습니다. 다양한 돌연변이가 검출되고 클론의 69%는 프레임 또는 조기 정지 돌연변이에서 보여줍니다. 이 절차로 성공하려면 높은 바이러스 백신 재고의 준비와 조혈 세포의 트랜스포메이션 및 이식을위한 최적화 된 조건이 필요합니다.
우리는 심장 혈관 질병의 법칙을 연구하기 위해이 기술을 적용했습니다. 그러나 혈액학적 악성 종양을 연구하는 것도 유용합니다. 이 방법을 사용하면 고효율이고 높은 방식으로 조혈 시스템에서 새로운 유형의 유전자 기능을 연구 할 수 있습니다.
우리는 형질 전환 마우스의 가용성을 통해 이것을 수집합니다.
