Immunology and Infection
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Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia
Chapters
Summary October 3rd, 2019
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Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.
Transcript
Abbiamo sviluppato un metodo efficiente ed economico per stabilire topi con manipolazione genica in particolare nelle cellule staminali ematopoietiche, utilizzando la tecnologia di editing del genoma e i sistemi di somministrazione transgene mediati dal lentivirus. Il vantaggio di questo protocollo è che possiamo creare modelli animali che ospitano mutazioni specifiche nelle cellule ematopoietiche in modo rapido ed economico rispetto agli approcci transgenici convenzionali del topo. A dimostrare la procedura sarà Ying Wang, un ricercatore del mio laboratorio.
Per generare particelle di lentivirus, inizia codificando una piastra di sei pozza con soluzione di collagene e incubandola a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Quindi, seminare cellule 293T sul piatto e incubarlo per altre due ore. Nel frattempo, preparare la miscela di tre plasmidi di trasfezione combinando 0,9 microgrammi di vettore di lentivirus, 0,6 microgrammi di psPAX2 e 0,3 microgrammi di pMD2.
G e deionizzato a 10 microlitri per pozzo. Quindi, aggiungere con cura 50 microlitri di 1X PBS e cinque microlitri di PEI MAX diluito alla miscela plasmide e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di DMEM.
Aspirare il supporto dalla piastra dei sei pozzetti e aggiungere un millilitro di miscela plasmide ad ogni pozzo. Incubare il piatto per altre tre ore. Sostituire il supporto con DMEM fresco e incubare per 24 ore.
Aggiungere un millilitro di DMEM fresco e incubare altre 24 ore. Dopo un'incubazione totale di 48 ore, trasferire il supernatante in un tubo da 50 millilitri e centrifugarlo a 3000 volte G per 15 minuti per rimuovere eventuali cellule galleggianti. Filtrare il supernatante attraverso un filtro da 0,45 micrometri e ultra-centrifugarlo per tre ore.
Aspirare con cura il supernatante, lasciandosi alle spalle il pellet bianco. Sospendere di nuovo il pellet con 100 microlitri di mezzo di espansione cellulare ematopoietico privo di siero senza aerazione. Mantenere un'aliquota di 10 microliter per misurare il ttarettare virale e conservare il resto della sospensione a meno 80 Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.
Dopo aver isolato le ossa, posizionarle in un tubo conico da 50 millilitri con RPMI e posizionare il tubo sul ghiaccio. In un armadietto di biosicurezza, trasferire le ossa in un piatto sterile da coltura da 100 millimetri. Quindi afferrare un osso con le forcetrici smussate e utilizzare le forbici di dissezione per tagliare con cura entrambe le epifisi.
Riempire una siringa da 10 millilitri con RPMI ghiacciato e utilizzare un ago calibro 22 per sciacquare il midollo osseo dall'albero in un nuovo piatto da coltura da 100 millimetri. Dopo che tutto il midollo osseo è stato raccolto, effettuare una sospensione a singola cella passando il midollo osseo attraverso una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 18. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.
Quindi centrifuga il tubo secondo le indicazioni del manoscritto e aspira il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet di cella in un volume appropriato di tampone di separazione ottimizzato. Per isolare le cellule negative del lignaggio, utilizzare un kit di esaurimento delle celle di lignaggio secondo le istruzioni del produttore.
Sospendere di nuovo le cellule negative isolate del lignaggio nel mezzo di espansione delle cellule ematopoietiche privo di siero. Pre-incubare le cellule a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5% per due ore. Quindi aggiungere il lentivirus secondo le indicazioni del manoscritto e lasciare le cellule nell'incubatrice per altre 16-20 ore.
Il giorno dopo, raccogliere le cellule trasdutite dal lentivirus in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarle a 300 volte G per 10 minuti. Secondo le linee guida NHA, è importante gestire i vettori del lentivirus al livello due del Gruppo Reece. Devono essere prese precauzioni, in base alle norme sulle strutture.
Aspirare con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 200 microlitri di RPMI per mouse. Mantenere le cellule a temperatura ambiente fino al trapianto nei topi. Dopo la seconda sessione di irradiazione, iniettare retro-orbitalmente cellule negative delineate in ogni topo anestetizzato utilizzando una siringa per insulina.
Da tre a quattro settimane dopo il trapianto di midollo osseo, ottenere campioni di sangue dalla vena retro-orbitale usando tubi capillari. Trasferire 20 microlitri di sangue in provette di polistirolo a fondo rotondo e posizionarli sul ghiaccio. Dopo la lisi RBC, incubare le cellule con un cocktail di anticorpi monoclonali al buio per 20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, lavare, fissare e centrifugare le cellule e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 400 microlitri di tampone FACS. Mantenere i campioni a quattro gradi Celsius fino all'analisi per citometria del flusso. Il successo della trasduzione di cellule negative del lignaggio può essere valutato con il rilevamento citometrico del flusso della RFP.
È stato dimostrato che dopo sette giorni di coltura in vitro, in media, il 75,7 per cento delle cellule viene trasdotto. La citometria a flusso è stata anche utilizzata per analizzare il sangue periferico del topo dopo la ricostituzione con cellule staminali ematopoietiche trasdotto e non trasdotto. Una media del 94,8% dei neutrofili, del 93,5% dei monociti e dell'82,7% delle cellule B esprime RFP.
Il DNA genomico delle cellule del sangue positive alla RFP è stato amplificato e sotto-clonato per l'analisi delle sequenze. Vengono rilevate varie mutazioni e il 69% dei cloni mostra mutazioni frame o premature stop. Per avere successo con questa procedura, è necessaria la preparazione di un elevato stock antivirus e condizioni ottimizzate per la trasduzione e il trapianto di cellule ematopoietiche.
Abbiamo applicato questa tecnica per studiare la legge della malattia cardio-vascolare. Ma è anche utile studiare la malignità ematologica. Questo metodo ci consente di studiare le funzioni di nuovi tipi di geni nel sistema ematopoietico in modo efficiente e elevato.
Lo raccogliamo sulla disponibilità di topi transgenici.
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