Biology
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Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione
Chapters
Summary October 15th, 2019
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Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.
Transcript
La profilazione del microbioma è il primo passo verso la definizione del ruolo del microbioma nella salute e nelle malattie. Qui, stiamo descrivendo una semplice procedura per isolare il DNA batterico di alta qualità dalla libreria di preparazione del campione fecale, eseguendo l'RNA 16SR e un sequenziamento meta genomico e l'analisi dei dati del microbioma. Questo protocollo aiuterà i ricercatori nuovi nel campo del microbioma, così come i ricercatori che lavorano nel campo del microbioma nella creazione della pipeline del microbioma nel loro laboratorio. Questo protocollo può essere esteso per la profilazione del microbioma da altri campioni bio come campioni nasali, orali o cutanei di soggetti animali e umani. La raccolta delle perline è il passo più importante in quanto tutti i passaggi a valle dipendono da DNA di alta qualità. Una corretta sigillatura della piastra di conservazione è importante in quanto la sigillatura incompleta potrebbe portare all'opprimente del prodotto amplificato con conseguente dati di sequenziamento di bassa qualità. Per iniziare, sterilizzare le scatole divisori con il 70% di etanolo. Posizionare i topi in scatole divisorie sterilizzate e consentire loro di defecare normalmente per un massimo di un'ora. Utilizzare forcep sterili per raccogliere i pellet fecali in un tubo di micro centrifuga vuoto pre-etichettato da 1,5 millilitri. Racchiudere il tubo in modo sicuro. Sterilizzare le forcep con il 70% di etanolo, seguite da una salvietta monouso germicida, dopo aver raccolto fecale da ogni topo. Pesare 200 milligrammi di pellet fecali in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri, con perline di vetro da 0,1 millilitro, e posizionare il tubo di perline in un omogeneizzatore che batte le perline e omogeneizzare i campioni per 45 secondi a temperatura ambiente, ad una velocità di 4,5 metri al secondo. Estrarre il DNA secondo le istruzioni del produttore del kit ed elute DNA in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver isolato il DNA, quantificare il DNA isolato caricando 1 microlitro del DNA su un fluorometro. Imposta l'amplificazione genica dell'RNA ribosomiale 16S PCR1 in una piastra PCR a 96 pozzetti, utilizzando un volume di reazione di 25 microliter. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 nano grammi di DNA, 13,5 micro litri di miscela enzimatica polimerasi ad alta fedeltà 2X, contenente tampone, più DNTP in primer avanti e indietro. Sigillare correttamente la piastra PCR dall'alto verso il basso lungo tutti e quattro i bordi. E centrifuga a 1000 volte G a 20
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