Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation
Chapters
Summary August 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kvantitativ multiplex Immunoprecipitation (QMI) bruger flow cytometri til følsom påvisning af forskelle i den overflod af målrettede protein-protein interaktioner mellem to prøver. QMI kan udføres ved hjælp af en lille mængde biomateriale, kræver ikke genetisk manipulerede Tags, og kan tilpasses til alle tidligere definerede protein interaktion netværk.
Transcript
Kvantitativ multiplexed co-immunoprecipitation, eller QMI, giver brugerne mulighed for samtidig at måle hundredvis af binære interaktioner i et foruddefineret protein interaktion netværk. Ved at udføre flere co-IPs samtidig i samme lysat, bioinformatik teknikker kan derefter undersøge, hvordan grupper af co-foreninger ændre sig på en koordineret måde. Analysen er tidskrævende at udvikle, men når QMI panelet er i hånd netværk skala data kan indsamles om signal transduktionssystemer i en relativt enkelt natten assay.
QMI kræver nøjagtig pipettering af forskellige prøver og reagenser i 96 brøndplader. Omhyggelige noter bør tages, når du konfigurerer og kører hver analyse for at undgå fejl. Ved prøvepræparat og immunudgivelse påbegyndes prøven i et egnet vaskemiddel med protease- og fosfatasehæmmere i en 15 minutters inkubation på is.
Ved inkubationens afslutning drejes prøven ned for at fjerne membraner og snavs og udføre en BCA-analyse på supernatanten for at bestemme proteinkoncentrationen i henhold til standardprotokollerne. Efter normalisering af proteinkoncentrationerne forberedes en magnetisk perlemasterblanding, der indeholder ca. 250 magnetiske perler af hver klasse pr. brønd. Brug magnetisk adskillelse til at vaske den magnetiske perleblanding to gange i Fly P-buffer, før perlerne resuspenderes i 20 mikroliter Fly P-buffer pr. prøve.
Efter en grundig pipettering, aliquot 20 mikroliter af perler i en iskold mikrocentrifuge rør pr prøve og tilsæt lige store mængder lysate med normaliserede protein koncentrationer til hvert rør for immunoprecipitation. Derefter opdeles hver lysatprøve i et rør for hver plade, der køres, og immunoprecipitat prøverne på en rotator ved fire grader Celsius natten beskyttet mod lys. Den næste morgen bruge en magnetisk perle rack til at fjerne lysatet fra det første sæt af rør og vaske perlerne to gange i 500 mikroliter af iskold Flyve P buffer per vask.
Efter beregning af resuspension volumen, resuspendrer immunoprecipitates i den beregnede mængde iskold Fly P buffer. Grundigt resuspend de magnetiske perler ved blid pipettering og distribuere 25 mikroliter af perler pr godt over en flad bund 96 godt plade på is. I en anden 96 brøndplade fortyndes af attinilerede sondeantistoffer til en to gange arbejdskoncentration.
Brug en multikanalpipette til at fordele 25 mikroliter af hver sondeantistoffortynding i de relevante brønde i den magnetiske perle, der indeholder analyseplade, og ryst med høj hastighed på en vandret pladeryser for at blande og opslænke de magnetiske perler. Efter blanding, reducere hastigheden for en time inkubation ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladen tre gange med frisk Fly P-buffer pr. vask på en magnetisk pladevasker ved fire grader Celsius.
Efter den sidste vask, resuspend perlerne i 50 mikroliter af streptavidin PE fortyndet en til 200 i Fly P buffer. Ryst blandingen og resuspend perlerne før inkubering af pladen ved fire grader Celsius i 30 minutter beskyttet mod lys. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladen tre gange med Fly P-buffer på en magnetisk pladevasker ved fire grader Celsius og resuspenderede perlerne i 125 mikroliter Fly P-buffer.
Ryst pladen i et minut ved 900 omdrejninger for grundigt at opslænke perlerne og lægge pladen i et refridgerated flow cytometer. I flow cytometer software, skal du vælge High RP1 Target indstilling, en stop tilstand på 1, 000 perler pr region, og en prøve volumen på 80 mikroliter. Pause løbet halvvejs igennem og resuspenderede perlerne for at forhindre afregning.
Eksporter datafilerne i XML-formatet i slutningen af kørslen. Hvis du vil udføre ANC-analyse, skal du udfylde ANC-inputfilen, så den afspejler detaljerne i det eksperimentelle design og kører programmet, som vil skrive en CSV-fil ind i den aktive mappe. Filen ender i hits.
csv vil rapportere de protein co-associationer, der er væsentligt forskellige på et falsk positivt niveau på 0,05 mellem kontrol og eksperimentelle betingelser i mindst tre ud af fire eksperimentelle replikater. Hvis du vil have vægtet korrelationsnetværksanalyse, skal du indsætte kolonnetitlerne for datafiloutputtet ved matlab, der ender i mfi. csv i den første kolonne i et nyt regneark og tilføje kolonnerne Eksperiment for eksperimentnummer og behandling til eksperimentel behandling og andre variabler, der skal analyseres.
Gem denne fil som træk. csv og åbne R Studio. Indstil arbejdsmappen til en mappe, der indeholder mfi'en.
csv og træk. csv-filer, fremhæv afsnit af kode, og tryk på Kommando Enter for at køre R-kommandoerne som angivet i den kommenterede kommandofil. De vægtede korrelationsnetværksanalysemoduler, der er væsentligt korreleret med hvert eksperimentelt træk, vil blive udoutputeret som en grafisk fil, og sammenhængen mellem hver interaktion med hvert modul vil blive outputtet som en CSV-fil.
For hver interaktion i ANC-outputfilen skal du identificere, om denne interaktion også er væsentlig af CNA, og oprette en ny kolonne, der angiver, om hvert ANC-hit også er et CNA-hit. Konverter værdierne for at logge to gange ændring og beregne den gennemsnitlige værdi for alle ANC union CNA hits. Endelig lave et nyt regneark med hver ANC union CNA hit opført af sin immunoprecipitation mål i en kolonne, dens sonde mål i den anden kolonne, og dens fold ændre værdi i tredje kolonne.
Importer denne fil til Cytoscape som et netværk for at oprette et nodekantdiagram. Højtillid protein interaktioner identificeret ved de to uafhængige statistiske tilgange visualiseres som node kant diagrammer ved hjælp af open source-software, Cytoscape, eller som heatmaps ved hjælp af R-kode og analyse instruktioner, der indgår i det supplerende materiale. I hele protokollen skal brugerne passe på at pipette nøjagtigt, at føre omhyggelige optegnelser og holde prøverne kolde hele tiden.
Vi har brugt QMI til at forstå, hvordan signaltransduktionsveje skelner mellem forskellige inputtyper og integrerer oplysninger fra flere receptorer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
