Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Стволовые клетки- производные вирусные Ag-специфические T Лимфоциты подавить HBV репликации у мышей
Summary September 25th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Представлен протокол для эффективного подавления вируса гепатита В (HBV) репликации у мышей с помощью приемной передачи клеток (ACT) стволовых клеток полученных вирусных антигенов (Ag)-специфических Т-лимфоцитов. Эта процедура может быть адаптирована для потенциальной аСТ на основе иммунотерапии HBV инфекции.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в приемной передачи клеток iPSC полученных вирусных антиген-специфических Т-клеток для эффективного подавления репликации HBV у мышей. Основным преимуществом этой техники является то, что iPSC полученных вирусных антиген-специфических Т-клеток имеют один тип Т-клеточных рецепторов и наивный фенотип. Для дифференциации HBV-специфических iPSC CD8-положительных Т-клеток, пластина s183 T-клеточных рецепторов ген-трансфуцированных iPSCs на OP9-DL1/DL4 монослой в альфа-минимум среды дополняется 20%фетальной сыворотки крупного рогатого скота и murine Flt3 лиганд для их совместной культуры в инкубаторе клеточной культуры.
Регулярно следите за совместной культурой для оценки морфологии клеток. На 28-й день удалите супернатантные и плавающие клетки и отсоедините клетки-адепты 0,25%трипсином. Когда клетки поднимаются со дна контейнера культуры, остановить энзиматической реакции с восемью миллилитров iPSC среды, и собирать клетки центрифугации.
Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров свежей среды. Разбавить клетки до одного iPSC-производных CD8-положительных Т-клеток до четырех s183 пептид-импульсный спланоцитов соотношение для 40-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В течение последних семи часов добавьте в культуру четыре микролитера разбавленного брефельдина А, чтобы блокировать транспортные процессы во время активации ячейки.
Пятно клеток для потока цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, представляющих интерес в соответствии со стандартными протоколами. Для гидродинамической плазмидной доставки HBV через хвостовую вену разбавляют 10 микрограммов плазмиды HBV в 8%эквивалентной массе тела PBS. Загрузите плазмид в один трехми миллилитровый шприц, оснащенный 26-дюймовой иглой на мышь.
Нагрейте мышей HHD под тепловой лампой в течение пяти минут, чтобы расширить хвостовые вены, и осторожно потяните мышь в пластиковый хеверитель. Найдите расширенную боковой хвостовой вены в средней трети хвоста и вставьте иглу параллельно вене, чтобы доставить весь объем плазмиды через хвостовую вену в течение трех-пяти секунд. Для вирусных антиген-специфических iPSC-производных CD8-положительных Т-клеток приемной передачи клеток, собирать iPSC CD8-положительных Т-клеток на 22-й день культуры, как попродемонстрировано, и семян клеток на новый 10-сантиметровый элемент культуры блюдо.
После 30 минут в инкубаторе культуры клеток, фильтруйте плавающие клетки через 70-микрометровый нейлоновый ситечко, и подсчитайте жизнеспособные клетки. Разбавить клетки в 1,5 раза от 10 до семи клеток на миллилитр концентрации PBS. Ввими 200 микролитров клеток в отдельных четырех-шестинедельных мышей HHD, в хвостовую вену, как только что продемонстрировано.
На 14-й день после переноса ячейки выполните гидродинамическую плазмиду HBV, как это было продемонстрировано. В соответствующих экспериментальных конечных точках после заражения, урожай печени от каждого инфицированного животного, и сократить печени на 0,5-на-0,5 на 0,3-сантиметровой ткани образцов. Поместите образцы в 10%нейтральный буфер формалин в течение четырех-24 часов, а затем декалкации в 2,5-молярной формовой кислоты в течение шести-24 часов.
Затем промыть образцы в ксилене в течение трех минут, а затем две две минуты полоскания в 100% этанола, 95% этанола, и деионизированной воды. После последнего мытья воды, decalcify тканей в один миллимолярной EDTA при температуре 90 градусов по Цельсию, а затем 30-минутный инкубации при комнатной температуре. Когда ткань остынет, промыть образцы в PBS в течение четырех минут, и использовать ксилен и этанол для депарафинизации и регидратации образцов.
Для иммунофлуоресцентной маркировки, пятно разделов с 200 микролитров ВГВ поверхности антиген-специфических антител в течение двух часов при комнатной температуре в 75 до 100% увлажненной камеры. В конце инкубации, мыть образцы с пятью пять минут моет в свежем PBS для каждой стирки. Наклеить клетки с DAPI в соответствии со стандартными протоколами перед монтажом слайдов с крышками для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.
Для иммуногистохимического анализа, пятно разделов с гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными протоколами, и оценить проникновение воспалительных клеток в печень с помощью легкой микроскопии. Поток цитометрического анализа iPSC полученных CD3-положительных CD8-положительной популяции показывает, что HBV Т-клеток рецепторов трансдукции резко увеличивает генерацию вирусных s183-специфических CD8-положительных Т-клеток. После стимуляции с Т-обедненных спеноцитов пульсировал с s183 пептид, CD4-отрицательный CD8 одно-положительных IPSC полученных Т-клеток производят большое количество интерферона гамма, как обнаружено внутриклеточного потока цитометрического анализа и ELISA.
После инфекции ВГВ путем гидродинамической инъекции репликация ДНК достигает пика на шестой день и постепенно уменьшается, как это наблюдается при анализе ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, вирусная репликация значительно снижается в любое время точки у мышей, которые получают HBV вирусных антигенных конкретных Т-клеток по сравнению с мышами, которые получают контрольные клетки. HBV поверхностный белок также существенно снижается у мышей, которые получают HBV вирусный антиген-специфических до iPSC цитотоксических лимфоцитов по сравнению с мышами, обработанных контрольными клетками, ясно демонстрируя, что вирусный антиген-специфический iPSC CD8-положительные Т-клетки имеют возможность уменьшить репликацию HBV в модели murine.
Теперь вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать вирусные антиген-специфические Т-клетки из iPSC для приемной иммунотерапии.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
Login to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.