Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Journal (Immunology and Infection)

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Journal (Immunology and Infection)

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Click here for the English version

Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system

Article DOI: 10.3791/60060-v

September 20th, 2019 •

Kristi J. Warren^1,3, Todd A. Wyatt^2,3,4

¹Department of Internal Medicine, University of Utah, ²Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, ³Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, ⁴Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 20th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

I denne protokol er lymfocytter placeret i det øverste kammer af et transmigrerings system, adskilt fra det nederste kammer af en porøs membran. Chemokin tilsættes til det nederste kammer, som inducerer aktiv migration langs en chemokine gradient. Efter 48 h tælles lymfocytter i begge kamre for at kvantificere overførsel.

Transcript

Lymfocyt transmigration er et vigtigt element i enhver immunrespons. Derfor er denne protokol er betydelig, fordi det giver en forsker mulighed for at vurdere mobiliteten af lymfocytter i et veldefineret in vitro-system. Den største fordel ved denne teknik er, at forskellige chemokines kan vurderes for at bestemme deres effektivitet af inducerende migration i nyligt definerede celler, såsom gruppen to medfødte lymfoide celler, eller ILC2.

En anden fordel er, at inhibitorer eller biologiske behandlinger med henblik på at blokere bestemte chemokin veje kan testes ved denne metode, før du gør dyrere forsøg med dyr. Begynd med at ekscisere lunger og milt fra aflivede ægbehandlede han- og hunmus med to til tre dyr pr. gruppe. Læg punkterede væv i separate dissociationsrør efter vævstype og dyresked.

Placer lungevævet i 500 mikroliter af lungeekskiveringsmedier i et dissociationsrør, anbring røret i den automatiserede vævseksociator, og dissocier det ved hjælp af lungeprotokollen. Gentag disse trin i alt to gange. For at adskille miltvæv skal du placere det i 500 mikroliter af komplette RPMI-medier i dissociatoren og derefter bruge miltprotokollen.

Arbejde i et biologisk sikkerhedsskab ved hjælp af steril teknik fra nu af, filtrere hvert dissocieret væv gennem en 40-mikrometercellestiter, og samles i 50-milliliter koniske rør. Dissociationsrør, der indeholder lungehomogenater, skylles med fem milliliter yderligere lungeeksocieringsmedier, rør, der indeholder milt homogenater med fem milliliter komplet RPMI, og filtrere deres indhold gennem de filtre, der anvendes til deres tilsvarende væv. For yderligere at adskille lungevæv, inkubere lunge homogenater i 15 til 30 minutter i en 37-graders Celsius inkubator med 5% kuldioxid.

Derefter tilsættes fem milliliter komplet RPMI til både lunge og milt homogenater, og centrifuge. Efter udsmid af supernatanten kombineres pellets, der indeholder miltytter og lungeceller fra gruppen af dyr af samme køn, i et enkelt konisk rør på 50 milliliter. Tilsæt 10 milliliter komplet RPMI til hvert rør, og resuspend.

Bestem det samlede celletal ved hjælp af en automatisk celletæller. Juster han- og huncellesuspensioner til 100 millioner celler pr. milliliter i separationsbuffer, og tilføj derefter et fem milliliter polystyrenrør. Efter isolering af gruppe to medfødte lymfoide celler fra 2/3 af de samlede celler som beskrevet i manuskriptet, skal du bruge de resterende celler til den CD4-positive T-celleisoleringsprocedure.

For at starte CD4-positiv T-celleisolering skal der tilføjes rotteserum til CD4 T-celleberigelsesaffjedringen. Derefter tilsættes isolation cocktail til cellen prøve, og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Vortex hurtige kugler i 30 sekunder, og tilsæt til celleprøven for at opnå en fortynding af 75 mikroliter pr. milliliter.

Bland forsigtigt og inkuberes i 2 1/2 minutter ved stuetemperatur. Top prøverne med ca. to milliliter separationsbuffer op til tre milliliter, læg de fem milliliterrør i den ottekammerbaserede separationsmagnet og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter tip magneten fremad, og pipette hver celle suspension i en ren fem-milliliter rør.

Der tilsættes 1,5 milliliter serumfri RPMI til hvert rør og centrifuge. Hæld supernatanten af, og ophjæld den CD4-positive T-cellepille ved 10 millioner celler pr. milliliter i serumfri RPMI. For at starte denne del af protokollen skal du bestemme antallet af Transwell-skær, der er nødvendige for eksperimentet for både ILC2- og CD4-positive T-celler som beskrevet i manuskriptet.

Flyt forsigtigt tre-mikron Transwell skær fra de midterste rækker af en 24-brønd plade til de øverste og nederste rækker af samme 24-brønd plade med en pipette spids og behandskede hænder. Tilføj 500 mikroliter af migrationsmedier med CCL17 til 1/3 af brøndene i den midterste række af 24-brøndpladen. Tilføj 500 mikroliter af migrationsmedier med CCL22 til en anden 1/3 af brøndene.

Og endelig tilsættes 500 mikroliter serumfri RPMI, der ikke indeholder chemokin, til de sidste 1/3 af brøndene. Mærk låget på pladen tydeligt med navnet på de relevante transmigrationsmedier placeret i bundbåsene. Derefter placere Transwell indsætter tilbage i brøndene, der indeholder de forskellige behandlinger.

Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter CD4 T-celler eller ILC2 til toppen af hver indsats, og sørg for ikke at blande eller pipette celleophænget op og ned i Transwells. Mærl låget på pladen tydeligt med celletypen placeret i hver brønd, og skriv den dato og det tidspunkt på dagen, hvor cellerne blev tilføjet. Gentag denne proces startende fra at fjerne Transwell-skær fra pladen, indtil alle cellerne er placeret i Transwell-skær med medier.

Når de celler af interesse er isoleret, de vigtigste skridt er at holde styr på de kemofiner og celletyper, der er placeret i bestemte brønde, at forsigtigt tilføje celler til de øverste kamre, og endelig for at undgå unødvendig kontakt med transmigration plade under 48-timers inkubation. Anbring forsigtigt pladen i en 37-graders Celsius-inkubator med 5 % kuldioxid, og inkuber den i 48 timer, og sørg for at minimere kontakt med pladen i inkubationstiden. Når pladen er fjernet fra inkubatoren, fjernes alle Transwell-skær fra de midterste rækker i de tomme brønde lige over eller under.

Indsamle celler fra toppen og bunden brønde af Transwell indsætter i rør mærket med top eller bund med CCL17, CCL22, eller medier, med celletype, og med replikeret nummer. Skyl bundboerne med 500 mikroliter på 1x PBS, opsaml dem i de tilsvarende rør, og gør det samme for de øverste brønde. Centrifuge rørene ved 378 gange g ved stuetemperatur i fem minutter.

Brug en pipette til forsigtigt at fjerne alle supernatant, og derefter resuspend T celle og ILC2 pellets med 50 mikroliter af 1x PBS. Efter fjernelse af 10 mikroliter af cellesuspensionen tilsættes 90 mikroliter på 0,4 % trypanblå. Tæl cellerne på den automatiserede celletæller.

Og for hver prøve skal du registrere procentdelen af levedygtighed og celletal pr. milliliter og bestemme det samlede antal celler pr. behandling i det øverste og nederste kammer. Når CCR4-udtrykket blev vurderet på både CD4-positive T-celler og ILC2 ved flowcytometri, var der ingen forskelle mellem mandlige og kvindelige værter. Ekspressionen af CCR4 pr. celle på ILC2 var imidlertid højere sammenlignet med CD4-positive T-celler.

Når det nederste kammer i Transwell-apparatet var fyldt med ubehandlede cellekulturmedier, medier, der indeholder CCL22, eller medier, der indeholder CCL17, migrerede mindre end 14 % af cellerne under mediekontrolforhold. Som svar på CCL22, begge celletyper, uanset om de var fra mandlige eller kvindelige værter, reagerede på CCL22. Også, CCL22 induceret større migration end CCL17 i mandlige ILC2.

På den anden side fremkaldte CCL17 signifikant migration af de kvindelige CD4 T-celler og ILC2 sammenlignet med medierne alene. CCL17 behandling var ikke anderledes end medier for mandlige CD4-positive T-celler eller mandlige ILC2. Under suboptimale forhold, når pladen med CD4 celler forblev ved stuetemperatur for de første 24 timer og derefter flyttet ind i inkubatoren, var der ingen migration mod CCL22 og CCL17.

Desuden var cellernes levedygtighed især lav for cellerne i bundkammeret, hvilket viste vigtigheden af at anvende de korrekte temperaturer og tilstande, der er beskrevet i denne protokol, for at opnå optimale resultater. Når transmigrationsproceduren er afsluttet, bør man se en betydelig migration til chemokin af interesse i forhold til medierne kontrol brønde. Hvis der ikke er signifikant migration set, kan man antage, at proceduren ikke fungerede korrekt, eller at lymfocytter ikke reagerer på chemokine pågældende.

Denne teknik kan bruges bredt til at forstå lymfocyt migration, når disse lymfocytter har gennemgået en bred vifte af in vivo behandlinger.

X

Simple Hit Counter