Immunology and Infection
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外迁移系统中淋巴细胞迁移的评估
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Summary September 20th, 2019
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在此协议中，淋巴细胞被放置在迁移系统的顶室中，由多孔膜与底部腔室隔开。化学因子被添加到底部腔室，从而诱导沿化学基质梯度的活性迁移。48小时后，淋巴细胞在两个腔室计数，以定量迁移。
Transcript
淋巴细胞迁移是任何免疫反应的一个重要特征。因此，这个协议是重要的，因为它允许研究人员评估淋巴细胞在一个明确定义的体外系统的流动性。该技术的主要优点是，可以评估各种化疗素，以确定其诱导迁移在最近定义的细胞，如组两个先天淋巴细胞，或 ILC2 的有效性。
第二个优点是，在与动物进行更昂贵的实验之前，可以用这种方法测试抑制剂或生物疗法，以阻断特定的化疗途径。首先从安乐死的雌性小鼠中排出肺和肺，每组使用两到三只动物。根据组织类型和动物性别，将切除的组织放在单独的分离管中。
将肺组织放在500微升的肺分离培养子中，放在分离管中，将管放在自动组织分离器中，并使用肺方案将其分离。重复这些步骤总共两次。要分离脾脏组织，请将其放在分离器中 500 微升的完整 RPMI 介质中，然后使用脾脏协议。
从现在起，使用无菌技术在生物安全柜中工作，通过 40 微米细胞滤株过滤每个分离组织，并收集到 50 毫升锥形管中。用五毫升的额外肺分离介质冲洗含有肺均质的分离管，用五毫升完整的 RPMI 中含有脾质的管，并通过用于相应组织的过滤器过滤其内容。为了进一步分离肺组织，在37摄氏度的培养箱中孵育肺均质15至30分钟，并吸收5%的二氧化碳。
然后向肺和脾均质和离心机添加五毫升完整的 RPMI。丢弃上流剂后，将同性动物群中含有血细胞和肺细胞的颗粒组合成一个50毫升的圆锥管。在每个管中加入10毫升完整的RPMI，然后重新暂停。
使用自动单元格计数器确定总单元格计数。在分离缓冲液中，将男性和女性细胞悬浮液调整为每毫升1亿个细胞，然后加入5毫升聚苯乙烯管。在将两个先天淋巴细胞从手稿中描述的2/3细胞中分离后，使用剩余的细胞进行CD4阳性T细胞分离程序。
要开始CD4阳性T细胞分离，将大鼠血清加入CD4 T细胞富集悬浮液。然后将分离鸡尾酒加入细胞样本，在室温下孵育10分钟。涡流快速球体30秒，并添加到细胞样品中，实现每毫升75微升的稀释。
轻轻混合，在室温下孵育2 1~2分钟。在样品顶部，用约两毫升的分离缓冲液，最多三毫升，将五毫升管放入八室易分离磁铁中，并在室温下孵育五分钟。然后将磁铁向前倾斜，将每个细胞悬浮液移液器插入一个干净的五毫升管中。
在每个管和离心机中加入1.5毫升无血清RPMI。从上一提液中倒出，在无血清RPMI中以每毫升1000万细胞重新浇注CD4阳性T细胞颗粒。要开始协议的这一部分，请确定 ILC2 和 CD4 阳性 T 细胞实验所需的 Transwell 插入件数，如手稿中所述。
用移液器尖端和戴手套的手，轻轻地将三微米跨井刀片从 24 井板的中间行移动到同一 24 井板的顶部和底部行。在24孔板的中间行中，用CCL17加入500微升迁移介质，将CCL17添加到1/3的井中。将 500 微升迁移介质与 CCL22 添加到另外 1/3 的油井中。
最后，在井的最后1/3中加入500微升不含化疗的RPMI。将板盖清楚地贴上底部井中放置适当迁移介质的名称。然后，将Transwell插入回包含各种处理的井中。
轻轻将 100 微升 CD4 T 细胞或 ILC2 添加到每个刀片的顶部井中，确保不要在 Transwells 上下混合或移液细胞悬浮液。将板盖清楚地贴上每个井中的单元格类型标签，并写下添加单元格的日期和时间。从从板中卸下 Transwell 刀片开始重复此过程，直到所有电池都已放置在带介质的 Transwell 刀片中。
一旦感兴趣的细胞被分离，最重要的步骤是跟踪放置在特定孔中的化疗和细胞类型，轻轻地将细胞添加到顶部腔室，最后避免在48小时的孵化过程中与迁移板进行不必要的接触。将板轻轻放在37摄氏度的培养箱中，用5%的二氧化碳孵化48小时，确保在孵化期间尽量减少与板的接触。轻轻地从培养箱中取出板后，将中间行的所有 Transwell 刀片拆下到空井中，然后位于上方或下方。
从 Transwell 的顶部和底部孔收集细胞插入与 CCL17、CCL22 或介质、具有细胞类型和复制编号的上或下标记的管中。用 500 微升 1x PBS 冲洗底井，收集到相应的管中，对顶部井进行相同的操作。在室温下以378倍g离心管5分钟。
使用移液器轻轻去除所有上流液，然后用 50 微升 1x PBS 重新暂停 T 细胞和 ILC2 颗粒。去除10微升的细胞悬浮液后，加入90微升0.4%的蓝板。计算自动单元格计数器上的单元格。
对于每个样本，记录每毫升的生存能力和细胞计数百分比，并确定顶部和底部腔室中每次治疗的细胞总数。当通过流式细胞测定对CD4阳性T细胞和LC2进行CCR4表达评估时，男性和女性宿主之间没有差异。然而，与CD4阳性T细胞相比，CCR4在每细胞的表达高于CD4阳性T细胞。
当Transwell仪器的底部腔室充满未经处理的细胞培养基、含有CCL22的介质或含有CCL17的介质时，在介质控制条件下迁移的细胞不到14%。作为对CCL22的回应，这两种细胞类型，无论它们来自雄性还是雌性宿主，都响应了CCL22。此外，CCL22在男性CLC2中诱发的迁移比CCL17大。
另一方面，CCL17诱导女性CD4 T细胞和LC2与介质相比大量迁移。CCL17治疗与雄性CD4阳性T细胞或男性LC2的介质无不同。在次优条件下，当带CD4细胞的板在室温下保持24小时，然后进入孵化器时，没有向CCL22和CCL17迁移。
此外，底部腔室中的细胞的生存能力明显较低，表明使用本协议中描述的正确温度和条件实现最佳结果的重要性。一旦迁移程序完成，与介质控制井相比，人们应该看到大量迁移到感兴趣的化学。如果没有看到显著的迁移，可以假设程序不能正常工作，或者淋巴细胞对有关化疗没有反应。
当淋巴细胞经过广泛的体内治疗时，这种技术可以广泛用于理解淋巴细胞迁移。
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