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이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.
유전자 기능 과 질병의 연구는 인간 인구의 근간 특성에 의해 방해된다. 환자 특이적 및 제어 iPS 세포주의 다른 유전 적 배경은 주어진 기능적 분석에서 발견되는 분화 효율 및 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 유일한 차이점은 관심의 특정 돌연변이는 이 문제점을 극복하기 위하여 중요한 유전으로 동일하거나 동소성 선의 사용은 중요합니다.
많은 인간 질병은 CRISPR-Cas9 시스템으로 생성하기 어려울 수 있는 이종화구 돌연변이에 기인합니다. 이것은 매우 높은 주파수에서 발생할 수있는 비 표적 적 진상선에서 인델 돌연변이의 생성에 기인한다. 우리의 기술은 하나의 관심의 돌연변이를 항구두 수리 템플릿을 사용하여이 문제를 극복.
이 기술을 시도하는 모든 구문은 인간 다능성 줄기 세포 배양에 숙련되어야합니다. 식민지 따기의 비디오 데모는 정확한 크기와 형태뿐만 아니라 따기 및 스크리닝에 사용되는 기술을 표시하는 데 도움이 될 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 레오 카르데나스입니다.
먼저, 6웰 플레이트에 조사된 MEF에 인간 ESC를 플레이트합니다. 트랜스펙트 마스터 믹스를 준비합니다. 파이펫팅으로 섞고 실온에서 15분간 배양합니다.
세포가 70 ~80%의 합류에 도달하면, 세포와 잘 현명하게 수축하는 형질 전환 마스터 믹스를 추가하고 48시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 24시간마다 미디어를 변경합니다. 세포를 수확하려면 먼저 실온에서 3 분 동안 트리플 E로 세포를 배양하여 MEF를 효소적으로 제거합니다.
10 마이크로 몰라 ROCK 억제제와 HESC 배지의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 펠릿 세포는 3분 동안 300배 g로, 10개의 마이크로몰러 ROCK 억제제로 인간 ESC 배지의 0.5 밀리리터에서 다시 중단한다. 세포 현탁액을 35 미크론 세포 스트레이너 캡을 통해 5 밀리리터 튜브로 필터링합니다.
형광 활성화 세포 분류를 사용하여 살아있는 세포에 게이트와 녹색 형광 단백질 양성 세포를 정렬합니다. 다음으로, 최대 1.5배 10회 를 10센티미터 의 정산세포로 직접 10센티미터 의 접시로 이송하여 1~3개의 지하 막 매트릭스로 코팅하고, ROCK 억제제가 함유된 MEF및 인간 ESC 배지를 조사하였다. ROCK 억제제 없이 인간 ESC 배지를 사용하여 매일 배지를 변경합니다.
10 내지 15일 후에, 식민지는 직경이 대략 1 2 밀리미터입니다. 현미경으로 P200 파이펫을 사용하여 단일 클론을 조심스럽게 긁어 내고 세포를 파이펫으로 그립니다. 콜로니와 함께 작성된 배지에서 3~4회 부드럽게 파이프를 사용하여 96웰 플레이트의 우물에 세포를 분산시한다.
그런 다음 각 가이드 RNA에 대해 20 개의 콜로니를 선택하고 검사를 위해 PCR 스트립 튜브로 분배하십시오. 5 분 동안 10, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 이제, DNA와 소용돌이를 적극적으로 격리하기 위해 Proteinase K 버퍼의 20 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 배양합니다.
원심분리기는 10, 000배 G에서 5분간. 다음으로, 편집된 DNA의 PCR 스크리닝을 수행한다. 관심 영역을 증폭하도록 설계된 전방 및 역 프라이머를 포함한 마스터 믹스의 20 마이크로리터와 Proteinase K 다이제스트의 5개의 마이크로리터를 튜브에 추가합니다.
대조군 iPSC 라인에서 분리된 게놈 DNA를 사용하여 스크리닝 PCR을 수행할 때 깨끗한 앰플리콘을 확인합니다. 부피 아가로즈 젤에 의해 2.5 %의 무게에 70 ~ 90 볼트에서 전기 전구의 1 시간 다음 PCR 제품의 크기 변화를 평가합니다. 모든 크기 차이는 분열을 나타냅니다.
단일 가닥 올리고 DNA와 CRISPR-Cas9 플라스미드를 변형시키기 위해, 조사된 MEF에 대한 6웰 접시에 표적 세포주를 플레이트하여 하룻밤 동안 인큐베이션을 통해 70~80%의 인플루언스에 도달합니다. 설명된 바와 같이 형질 전환 반응을 설정합니다. 파이펫팅으로 반응을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
그런 다음, 세포에 현명하게 떨어지는 형질 전환 반응 혼합물을 추가한다. 48 시간 후에, 이전과 같이 세포 분류를 위한 세포를 준비합니다. 단일 세포를 도금 한 후 약 10 일, PCR 스트립 튜브에 식민지를 선택하고 젤라틴과 MEF로 미리 코팅 된 12 웰 플레이트의 우물에 200 마이크로 리터 파이펫을 사용합니다.
이전에 는 젤라틴으로 코팅되고 ROCK 억제제와 인간 ESC 배지에서 조사 MEFs24 또는 48 웰 플레이트의 각 우물에 세포의 100 마이크로 리터를 전송합니다. DNA 격리를 위해 나머지 100 마이크로리터를 사용합니다. 단일 가닥 올리고 DNA의 성공적인 통합을 확인하려면 이전에 설계된 스크리닝 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하기 위해 각 식민지에서 분리 된 DNA의 5 마이크로 리터를 복용하십시오.
PCR 제품을 정화하고 단일 스트랜드 올리고 DNA에서 생성 된 독특한 효소 부위를 사용하여 제한 효소 소화의 40 마이크로 리터를 준비합니다. 제조업체의 권장 온도에서 파이펫팅및 인큐베이션을 사용하여 반응을 1~3시간 동안 섞습니다. 이어서, 에디듐 브로마이드 아가로즈 젤, 전기전도80~100볼트에 40분 동안 1.5%의 중량으로 로딩 염료로 첨가된 소화PCR 제품을 시각화한다.
단일 가닥 올리고 DNA의 성공적인 통합이 발생한 경우 중첩 된 프라이머를 사용하여 서열 특정 돌연변이가 발생합니다. 이 연구에서는, 가이드 RNA 시공을 위해, 100개의 베이스 쌍 밴드가 1.5%의 아가로즈 젤로부터 절제되었다. 세포 형질전환 에 이어, 가이드 RNA 절단의 유효성 검사는 2.5%의 아가로즈 젤을 사용하여 시각화하였다.
180베이스 페어 PCR 제품은 인델 형성을 나타내는 밴드 시프트가 있는 절단되지 않은 컨트롤과 다른 클론을 보여주었습니다. 다른 가이드 RNA는 다른 절단 효율성을 했다. 편집된 알레일의 CRISPR-Cas9 재절단을 피하기 위해, PAM 서열은 G를 사용하여 자동 돌연변이로 수정하였다.
PAM 서열의 자동 돌연변이는 하나의 또는 두 개의 모두에 성공적인 통합을 위해 스크리딩하는 데 도움이 되는 고유한 제한 사이트를 생성했습니다. 게놈 편집 줄기 세포주 다운스트림 분화 및 기능적 분석은 인간의 발달과 질병에 주어진 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 이 방법론은 다양한 인간 질병에 연루된 특정 이종화구 또는 동종질 돌연변이를 가진 동종 세포주의 생성을 허용합니다.
이 질병 모형은 새로운 세포 치료의 발달을 위한 도로를 포장하고 약 발견을 위한 발판을 제안합니다.
