Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En høj-throughput In Situ metode til vurdering af Hepatocyt Nuklearploidy i mus
Summary April 19th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer en robust, omkostningseffektiv og fleksibel metode til måling af ændringer i hepatocytnummer og nukleart trick i faste/kryoreserverede vævsprøver, der ikke kræver flowcytometri. Vores tilgang giver en kraftfuld prøve-dækkende underskrift af levercytologi ideel til sporing af udviklingen af leverskader og sygdom.
Transcript
Denne metode gør det muligt for brugeren at generere en profil af hepatocyte nukleare DNA-indhold fra 2D væv sektioner til undersøgelse af leveren udvikling, regenerering, og kronisk sygdom. Denne automatiserede høj gennemløb tilgang kan anvendes på alle 2D levervæv sektioner, hvilket giver en internt kalibreret udlæsning af nukleare ploidy for alle enkle cirkulære hepatocyte kerner. Ændringer i hepatocyte nukleare ploidy er forbundet med aldring, kronisk leversygdom, og kræft.
Denne teknik giver et simpelt middel til at profilere nukleare ploidy i faste eller kryobevarede leverprøver. In situ ploidy profilering metoder har et betydeligt potentiale som forskning og kliniske værktøjer til sporing af leversygdom progression, da de ikke kræver væv desegregering eller adgang til nyt materiale. Efter høst af murine levervæv prøve, integrere leveren lobule i en optimal skæring temperatur medium fyldt kryolom og straks placere formen på tøris for at sikre hurtig frysning.
For at opnå skiver af den frosne lever lobule prøve, afsnit prøven på en seks mikrometer tykkelse, placere en mærket polyamid belagt dias over hver prøve i fem sekunder for at lade hver prøve holde sig til diaset. Når alle skiverne er indsamlet, skal prøverne kunne yrtre i tre til fem minutter ved stuetemperatur før immunmærkning. Ved afslutningen af ækvilibreringen fastgør vævsafsnittene i en røghætte med en milliliter 4%paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
Ved slutningen af fikseringen skylles objektglassene med tre tre minutters vask i PBS med let omrøring. Efter den sidste vask tørres området omkring hver vævssektion, og der anvendes en hydrofob pen til at tegne en cirkel rundt om hver prøve. For at gennemtrænge prøverne behandles sektionerne med et 0,5% ikke-ionisk overfladeaktivt stof i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne i tre minutter i PBS to gange med forsigtig omrøring som påvist, før den ikke-specifikke binding blokeres med en filtreret opløsning på 1 % kvægserumalbumen, 5 % hesteserum og 0,2 % ikke-ionisk overfladeaktivt stof i PBS i mindst en time ved stuetemperatur. Dernæst inkubere dias med HHF4-alpha antistof fortyndet i blokering buffer natten over ved fire grader Celsius i et fugtigt farvning kammer beskyttet mod lys. Næste morgen vaskes objektglassene fire gange i PBS med blid omrøring før inkubation med et passende fluorescenskonjugeret sekundært antistof og Hoechst fortyndet i filtreret 1% kvæg serumalbumen og 0,2 % ikke-ionisk overfladeaktivt stof i PBS i to timer ved stuetemperatur i et fugtigt farvningskammer, der er beskyttet mod lys.
Ved inkubationens afslutning vaskes objektglassene fire gange, således som det er påvist, efterfulgt af to tre minutters vask i dobbelt destilleret vand med let omrøring. Efter den sidste vask monteres prøverne med to dråber fluorescensmonteringsmedium på en dækslet og tryk forsigtigt på efter behov for at fjerne eventuelle bobler. Kontroller derefter rutsjebanerne ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop for at sikre god fiksering og immunmærkning.
For fluorescens billede erhvervelse, indstille parametrene på et højt indhold billeddannelse platform til at erhverve fluorescens billeder ved hjælp af passende excitation for fluorophores anvendes. Scan derefter prøver for at få tilstrækkelige billeder til at opnå fuldstændig dækning af vævssektionen. Ved scanningens afslutning justeres softwarens nukleare segmenteringsparametre for at sikre, at kernerne er optimalt adskilt, og tærskelintensiteten ændres for at sikre optimal gating af HNF4-alfa-positive hepatocytter og HNF4-alpha negative ikke-parenkymale celler.
For nuklear kvantificering, indstille det nukleare område i firkantede mikrometer baseret på Hoechst farvning, de vigtigste nukleare Hoechst intensitet, den nukleare forlængelse faktor, den gennemsnitlige nukleare rundhed indeks, HNF4-alpha status, og den nukleare X, Y koordinerer baseret på tyngdepunktet. For at udføre en hepatocyte nukleare ploidy analyse, først downloade og installere ploidy kvantificering analyseprogram. I MATLAB skal du navigere til fanen App på værktøjsstrimlen og klikke på Installer app.
Åbn programmet Ploidy Application ML App Install. Der vises en meddelelse, der bekræfter den vellykkede installation. I hver dataanalysefil skal du medtage et ark med betegnelsen Celleforanstaltninger, der indeholder alle de data, der er nødvendige for den ploidyanalyse, der er angivet i kolonner som angivet.
For hver forsøgstilstand skal der tilvejebringes et kontroldatasæt, der skal anvendes til at beregne den interne kontrol for to til fire N-kalibrering af nukleart ploidy. I forbindelse med biologiske replikere skal du gemme hvert regneark i sin egen mappe og navngive mappepræfikserne trinvist. Dernæst lancere Ploidy ansøgning.
Den grafiske brugergrænseflade i det grafiske brug af Det Ploidy-program vises. Klik på knappen Sti til Kontrol af data for at navigere til den mappe, som datarelikterne til kontrolelementet findes i. Denne datasti vises derefter i grænsefladen.
Skriv det navn, der skal gives til outputfilerne, i mappepræfikset. Klik på knappen Sti til andre data, og naviger til den mappe, hvor de komparative datarelikker findes. Denne datasti vises derefter i grænsefladen.
Klik derefter på Kør. Når analysen er fuldført, læses Analyse færdig. Efter immunmærkning er det vigtigt at kontrollere alle objektglassene ved konventionel fluorescensmikroskopi for at bekræfte, at der er opnået en fiksering og farvning af god kvalitet.
Udtværing eller sløring af Farvestoffet Hoechst kan indikere utilstrækkelig fiksering eller prøvenedbrydning før fiksering. Nuklear adskillelse og HNF4-alpha tærskelparametre bør optimeres omhyggeligt før automatisk billedanalyse for bredt at afspejle det visuelle mønster af immunstaining observeret ved fluorescensmikroskopi. Efter billedanalyse bør dataene afspejle det stigende antal ikke-parenkymale celler og de små, men signifikante, reduktion i HNF4-alpha positive kernetal i leveren med DDC-skade.
I sunde kontrollever udviser ca. 63% af HNF4-alfa positive kerner en simpel cirkulær morfometry. En sammenligning af den relative nukleare ploidy mellem kontrolgrupper og DDC-behandlede grupper bør afspejle et betydeligt tab på 2C og 4C hepatocytkerner med skade sammen med et øget antal celler på over 8 C. De relative positionsoplysninger for hver ploidy undergruppe kan afhøres ved at hente 2D-placeringen af bestemte hepatocyt-delmængder i analysesoftwaren med højt indhold.
Immunmærkning med yderligere antistoffer, såsom Ki-67, kan udføres for at vurdere cellereplikering og hepatocyt nukleare morfometry data kan yderligere afhøres for at komplimentere ploidy analyse. Den vævsdækkende ploidyprofil, der genereres ved denne metode, beskriver minimums-DNA-indholdet for alle cirkulære hepatocytekerner, men diskriminerer ikke mellem mononukleare celler og binuclear hepatocytter. Metoden kan potentielt tilpasses for at tage højde for parametre som celleomkreds, for at lette identifikationen af binuclear celler og give en ekstra udlæsning af cellulære ploidy.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
