Developmental Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hemogena omprogrammering av humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorer
Chapters
Summary November 4th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll visar induktion av en hemogena program i human dermal fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorerna GATA2, GFI1B och FOS för att generera hematopoietiska Stem och progenitorceller.
Transcript
Denna metod hjälper övervinna begränsningar i att studera mänskliga hematopoetiska utveckling genom att tillhandahålla en enkel och tractable in vitro plattform baserad på direkt cell omprogrammering. Visuell demonstration av denna metod kommer att ge idealisk vägledning i grundläggande steg för att generera mänskliga hemogenic celler nämligen under lentiviral produktion, fibroblast transduktion och cellkultur. Genom att omvandla huden fibroblaster till hemogenic prekursorer, hoppas vi att generera patientens specifika hematopoietic stamceller och stamceller celler i tillräckligt antal för stamcellstransplantation.
Börja med att odla HEK293T celler i en 100 millimeter vävnad kulturbehandlad skålen med 10 milliliter av komplett DMEM vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid tills sammanflödet. Dagen före transinfektion, efter aspirerande av mediet, tvätta skålen försiktigt med fem milliliter PBS och lossa cellerna med 1,5 milliliter dissociation lösning. Efter inkubering i fem till 10 minuter vid 37 grader Celsius, inaktivera lösningen med tre milliliter av komplett DMEM och överföra cellen suspensionen till en 15 milliliter konisk rör.
Tvätta skålen med 5 milliliter av komplett DMEM för att avlägsna eventuella kvarvarande bifogade celler och dra tvätten med celllösningen. Samla cellerna genom centrifugering, aspirera supernatanten och resuspend pelleten i sex milliliter av kompletta DMEM. Sedan dela suspensionen jämnt mellan sex 100 millimeter vävnad kulturbehandlade rätter i en slutlig volym av 10 milliliter av komplett DMEM per maträtt.
Nästa dag, tillsätt 10 mikrogram total massa av de tre överföring plasmider tillsammans till en ny 15 milliliter koniska röret. Därefter lägger du till 10 mikrogram av den andra generationen av psPAX2-förpackningsvektor som kodar för gag-, pol-, tat- och rev-gener följt av tillsats av fem mikrogram pMD2. G kuvertvektor kodning VSV-G genen till röret.
Slutligen, tillsätt vatten för att få den slutliga volymen till 500 mikroliter. I två nya 15 milliliter koniska rör, tillsätt 10 mikrogram FUW-M2rtTA plasmid, 10 mikrogram av förpackningen vektor, och fem mikrogram av kuvertet vektorn till varje rör. Tillsätt sedan vatten upp till en slutlig volym på 500 mikroliter till varje rör.
Därefter lägger du till 62,5 mikroliter av två molarkalciumklorid till vart och ett av de tre rören och använd en pipettstyrenhet utrustad med en Pasteur Pipette för att frigöra bubblor i varje blandning. Medan bubblorna bildas, tillsätt 500 mikroliter bes buffrade saltlösning droppvis mot Pasteur Pipette och på blandningen. Inkubera rören i rumstemperatur i minst 15 minuter tills blandningarna verkar något grumliga.
Under inkubationen, byt noggrant ut supernatanten för HEK293T-cellkulturerna med 10 milliliter av komplett DMEM utan antibiotika. Fördela DNA-komplexen droppvis på enskilda HEK293T cellodlingsrätter och inkubera i 24 timmar. Nästa dag, ersätta supernatanter med fyra milliliter av komplett DMEM per kultur och återgå rätter till en 37 grader Celsius 5%skolsulcell kultur inkubator över natten.
Nästa morgon, samla supernatanter i en 50 milliliter rör per skålen och tillsätt fyra milliliter färskt medium till varje maträtt. Efter ytterligare åtta timmars kultur, pool supernatant i varje maträtt med tidigare skördade supernatant och tillsätt fyra milliliter färskt medium. Returnera disken till cellkulturinkubatorn över natten och samla supernatanterna en sista gång.
När alla viruset har samlats in, filtrera varje lentiviral supernatant genom en 0,45 mikrometer låg proteinbindning filter i enskilda rör och tillsätt högst 15 milliliter filtrerade supernatant till enskilda centrifugal filterenheter för centrifugering. Kassera flödet igenom. Ett visköst lentivirus som innehåller vätska kommer att finnas kvar i filterenheten.
När alla lentiviral supernatant har filtrerats alikvot 50 till 200 mikroliter av de koncentrerade lentivirus för kylförvaring. Innan du påbörjar omprogrammeringsförfarandet, koda en sex väl vävnadskulturbehandlad platta med 500 mikroliter på 0,1%gelatin per brunn och inkubera plattan i 20 minuter vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen aspirerar du den återstående gelatinlösningen.
Plate humana dermal fibroblaster vid en densitet av 1,5 gånger tio till den femte celler per platta i två milliliter av komplett DMEM per brunn och inkubera över natten. Nästa morgon, ersätta mediet i varje brunn med två milliliter av komplett DMEM kompletteras med åtta mikrogram per milliliter polybrene och lägga till en en till en blandning av pool produceras transkriptionsfaktor lentiviruses och M2rtTA i en ny microcentrifuge röret. Därefter transduce fibroblasten med en optimal volym av den lentiviral blandningen, mellan 10 till 100 microliters per brunn.
Efter 16 timmars inkubation, byt ut supernatanterna med komplett DMEM och återför cellerna till cellodlingsinkubatorn i sex till åtta timmar. Efter återhämtningen, ersätta supernatanterna med två milliliter av komplett DMEM kompletteras med polybrene och utföra en andra transduktion som just visat. Vid slutet av den andra transduktionsinkubationen, byt ut supernatanterna mot komplett DMEM kompletterat med ett mikrogram per milliliter doxycyklin och returnera plattan till cellodlingsinkubatorn i 48 timmar.
Vid slutet av inkubationen, dela varje brunn vid ett ett till två förhållande och replate celler i två milliliter per brunn av hematopoietiska medium kompletteras med doxycyklin i en ny gelatin belagda sex väl platta. För att få ett tillräckligt antal celler för kromatin immunprecipitation sekvensering analys, platta tre gånger 10 till den femte fibroblaster i ett gelatin belagt sex väl platta och inkubera över natten. I slutet av inkubationen, transduce celler två gånger i två på varandra följande dagar med 10 till 20 mikroliter av lentivirus som innehåller de enskilda faktorer av intresse eller en pool av de tre faktorer plus FUW-M2rtTA vid ett ett till ett förhållande.
16 timmar efter den andra transduktionen, ta bort viruset som innehåller supernatant och inkubera cellerna i komplett DMEM i 24 timmar. I slutet av inkubationen, replate innehållet i varje brunn i enskilda gelatin belagda 100 millimeter vävnad kultur behandlade rätter med komplett DMEM till en slutlig volym av 10 milliliter medium per skålen, och returnera cellerna till cellkulturen inkubatorn. Efter sex dagar, ersätta supernatanten med komplett DMEM kompletterat med doxycyklin.
Återför kulturerna till inkubatorn i ytterligare två dagar. Som dessa representativa cytometri tomter visar, cirka 17%av omprogrammerade celler uttrycka både CD49f och CD9 efter 25 dagar av omprogrammering. Majoriteten av dubbla positiva celler uttrycker CD143 och en liten population uttrycka CD34, vilket tyder på en dynamisk hemogenic öde induktion.
Dessa markörer aktiveras inte i M2rtTA transduced human dermal fibroblasts odlade i 25 dagar. Immunofluorescens imaging bekräftar uttrycket av CD9 och CD143 i anhängare och runda celler som är morfologiskt åtskilda från fibroblaster, som är negativa för dessa markörer. Brightfeild imaging utförs för att visualisera cellkonfluency, morfologi och kolonibildning under hela omprogrammeringsprocessen.
Encellig RNA-sekvenseringsanalys av omprogrammerade celler avslöjar en stegvis ökning av CD49f, CD9 och CD143-uttryck från dag två till 25. Efter kromatin immunoprecipitation sekvensering, Genome Browser profiler visar GATA2 bindande för genomisk reglerande regioner i ITGA6 och ACE när fibroblaster är cotransduced med de tre faktorerna eller GATA2 individuellt. Volymen av antivirala partiklar som tillsätts i kulturen bör optimeras för framgångsrik omprogrammering utan att cellens livskraft äventyras.
Denna plattform kan kopplas ihop med farmakologisk hämning och genomskala screeningteknik, såsom CRISPR-Cas9, för att definiera nya regulatorer av mänskliga definitiva hematopoiesis. Denna direkta omprogrammering strategi kommer att göra det möjligt för forskare att utforska nya frågor inom området för mänskliga utvecklingsmässiga hematopoiesis och att dechiffrera mekanismer som ligger till grund för specifikationen av mänskliga hematopoetiska stamceller. Det är viktigt att utföra antivirala samlingar och transduktioner i en laminär flödeshuv dedikerad för lentiviralt arbete och att kassera viralt förorenat avfall till en lämplig behållare.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
