Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ग्लूटामेट रिलीज के एकल सिनैप्स संकेतक और सामान्य और हंटिंगटन चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में तेज
Chapters
Summary March 11th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
हम वयस्क चूहों से तीव्र स्लाइस में एकल कोर्टिकोस्टल ग्लूटामिटल ग्लूटाएग्नेस सिनेप्स में ग्लूटामेट रिलीज और निकासी के बीच संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल ग्लूटामेट डिटेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट सेंसर iGluयू, सिग्नल अधिग्रहण के लिए एक एससीएमओएस कैमरा और फोकल लेजर रोशनी के लिए एक डिवाइस का उपयोग करता है।
Transcript
एक फास्ट ग्लूटामेट सेंसर व्यक्त करने वाले एकल सिनैप्स का उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ट्रांसमीटर रिलीज और तेज के बीच स्थानीय बेमेल का पता लगाने की अनुमति देता है। बीमारी के मामले में, इस विधि का उपयोग बेकार सिनेप्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। ऑटोफ्लोरेसेंस सुधार के लिए, सबसे पहले, ब्याज के माउस से एक मस्तिष्क टुकड़ा एक फोटॉन माइक्रोस्कोप के रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें।
ऑक्सीजनयुक्त, कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ में टुकड़ा जलमग्न करें और पृष्ठीय स्ट्राटम का पता लगाने के लिए 20x पानी-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें। ऊतक आंदोलन को कम करने के लिए प्लैटिनम वीणा पर एक नायलॉन ग्रिड के साथ स्लाइस को ठीक करें, और 63x पानी-विसर्जन उद्देश्य पर स्विच करें। 510 नैनोमीटर पर एक उच्च पास फिल्टर का उपयोग करना, ऑटोफ्लोरेट और ग्लूटामेट सेंसर सकारात्मक संरचनाओं की एक छवि को एक साथ प्राप्त करें।
600 नैनोमीटर पर एक उच्च पास फ़िल्टर का उपयोग करना, अकेले ऑटोफ्लोरेटेंट संरचनाओं की दूसरी छवि प्राप्त करें। सीमा को परिभाषित करने के लिए, लाल और पीले रंग की छवियों को स्केल करने के लिए 10 प्रतिभाशाली और 10 अंधेरे पिक्सेल की औसत तीव्रता का उपयोग करें। फिर, पीले शून्य से लाल छवि का घटाव करें और ब्याज के बाउटन के सुविधाजनक दृश्य के लिए एक मानक 8-बिट झगड़ा फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए घटाया छवि को फिर से रीस्कैल करें।
उत्तरदायी boutons के लिए एक खोज करने के लिए, आप विद्युत उत्तेजना के लिए एक उपयुक्त ग्लास माइक्रोपिपेट की जरूरत है। लगभग एक माइक्रोमीटर के आंतरिक टिप व्यास के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से उत्तेजना पिपेट का उत्पादन करने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें। उम्मीदवार boutons के एक सेट से ग्लूटामेट की संभावित निर्भर रिहाई की कार्रवाई के लिए जांच करने के लिए, एक 63x आवर्धन और एक 510 नैनोमीटर उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें।
अतिरिक्त एक्सॉन की निकटता से बचने, फ्लोरोसेंट वैरिकासिटी के बगल में ग्लास उत्तेजना इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट की अनुमति देने के लिए घटाया छवि लोड करें। स्लाइस के गहरे हिस्से के भीतर अधिकतम विभाजन या आवंटन से जुड़ी वैरिकोसिटीज में क्या। उत्तेजना इलेक्ट्रोड को ब्याज के बाउटन के पास रखें और प्रकाश को बंद कर दें, क्योंकि रिकॉर्डिंग पूरी अंधेरे में की जानी चाहिए।
फिर, मल्टी-चैनल बाथ एप्लीकेशन सिस्टम को चालू करें, जिसमें एक चैनल मानक स्नान समाधान प्रदान करता है और अन्य चैनल कार्रवाई संभावित उत्पादन को अवरुद्ध करने के लिए टेट्रोटोटॉक्सिन सहित आयन चैनलों, ट्रांसपोर्टरों या झिल्ली रिसेप्टर्स के आवश्यक ब्लॉकर्स वितरित करते हैं। रिकॉर्डिंग की साइट पर प्रवाह को नियंत्रित करें और उत्तेजना पिपेट में दो से 10 माइक्रोएम्प्स की वर्तमान दालों को डीपोलराइज करने के लिए उत्तेजक को चालू करें। रिलीज अब वोल्टेज गेटेड चैनलों के माध्यम से सीधे कैल्शियम प्रवाह द्वारा सक्रिय है ।
माइक्रोस्कोप एक्स, वाई ड्राइव का उपयोग करके, क्लीयरेंस में ग्लूटामेट रिलीज की कल्पना करने के लिए, परीक्षण किए गए ग्लूटामेट सेंसर सकारात्मक बाउटन को व्यूफील्ड सेंटर के करीब रखें। अधिग्रहण को रोकने के बाद, एक्स, आराम bouton केंद्र की वाई स्थिति निर्धारित करने के लिए बाएं माउस बटन के साथ छवि पर क्लिक करें । सेट कर्सर के एक्स, वाई निर्देशांक प्रदर्शित किए जाएंगे।
अंशांकन डेटा का उपयोग करके, साइट के निर्देशांक की गणना करें जहां संकेत के अनुसार सूत्रों का उपयोग करके ग्लूटामेट सेंसर फ्लोरेसेंस के उत्तेजन के लिए लेजर बीम भेजा जाना चाहिए। लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एक बिंदु अनुक्रम बनाने के लिए, लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर के अनुक्रम पृष्ठ पर अनुक्रम बॉक्स में जोड़ने में बिंदु का चयन करें और रन सेट और शून्य करने के लिए देरी चलाने के लिए, और अनुक्रम TLL में चलाने के लिए । इसके बाद स्टार्ट सीक्वेंस पर क्लिक करें।
कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर में, उपयुक्त इमेजिंग पैरामीटर का चयन करें और ट्रिगर मोड के लिए बाहरी शुरुआत का चयन करें। कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर में सिग्नल लेने पर क्लिक करें। फिर, ट्रिगर डिवाइस के लिए निर्धारित प्रायोगिक प्रोटोकॉल शुरू करें, और उचित समयरेखा के साथ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल परीक्षण को लागू करें, ताकि कैमरा एक परीक्षण के दौरान 2.48 किलोहर्ट्ज आवृत्ति के साथ 400 फ्रेम प्राप्त कर सके, जिसमें 0.1 हर्ट्ज या कम पुनरावृत्ति आवृत्ति होगी।
रोग synapses की पहचान करने के लिए, ऊंचाई दिनचर्या चालू करें और आराम से ब्याज के चयनित क्षेत्र के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता, मतलब और मानक विचलन की गणना करें। निर्धारित करें और बॉक्स एक फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ पिक्सल द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र मतलब प्लस तीन मानक विचलन से अधिक आराम पर, और माइक्रोन में एक आभासी व्यास निर्धारित अधिप्रा दहलीज क्षेत्र के एक परिपत्र रूप संभालने । समय के खिलाफ फ्लोरेसेंस तीव्रता को प्लॉट करें, क्योंकि वास्तविक फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य और फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य के बीच का अंतर बाकी पर फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य से विभाजित होता है।
फ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया के शिखर आयाम का निर्धारण करें। फ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया के शिखर से क्षय के लिए एक मोनोएक्सोनेंटियल फिटिंग करें, और क्षय, तौड के समय को स्थिर निर्धारित करें। किसी दिए गए सिनेप्स पर अधिकतम आयाम का अनुमान लगाने के लिए, फ्लोरेसेंस तीव्रता में सबसे अधिक परिवर्तन के साथ पिक्सेल का चयन करें, जो सिनेप्स की निकासी मशीनरी को प्रस्तुत ग्लूटामेट लोड का सबसे अच्छा संकेतक है।
एकल सिनैप्स इमेजिंग का उपयोग आकार और युग्मित पल्स अनुपात मानदंडों का उपयोग करके कॉर्टिकोस्ट्रिटल सिनेप्स के दो वर्गों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। 20 से 50 मिलीसेकंड के प्रोत्साहन अंतराल पर, छोटे इंटरएंटरोपेफेलिक टर्मिनलों को पल्स डिप्रेशन से जोड़ा जाता है, जबकि बड़े पिरामिड ट्रैक्ट टर्मिनलों ने बनती हुई पल्स सुविधा दिखाई। जंगली प्रकार के चूहों और चूहों पर किए गए परीक्षण हंटिंगटन फेनोटाइप व्यक्त करते हैं, खुले मैदान में कुल पथ चलाने के लिए प्राप्त परिणामों के बीच एक महत्वपूर्ण सकारात्मक कूरिेशन प्रकट करते हैं, और विलंबता पर कदम।
इसके अलावा, एकल सिनेप्स ग्लूटामेट इमेजिंग से पता चलता है कि रोगसूचक हंटिंगटन चूहों ने एक सिनेप्स उत्तेजना के लिए ग्लूटामेट प्रतिक्रियाओं के ताऊड मूल्यों में परिलक्षित के रूप में मुक़ाबला ग्लूटामेट क्षय की गति में कमी का प्रदर्शन किया। जंगली प्रकार के जानवरों में, इस तरह के दीर्घीकरण को केवल ग्लूटामेट तेज के चयनात्मक, गैर-परिवहनीय अवरोधक के आवेदन के बाद देखा गया था। जंगली प्रकार के चूहों से स्लाइस में दिए गए TauD मूल्य की घटना की संभावना का मूल्यांकन, और हंटिंगटन रोग के लक्षणों को व्यक्त करने वाले चूहों ने खुलासा किया कि जंगली प्रकार के जानवरों में, TauD कभी भी 15 मिलीसेकंड से अधिक नहीं होता है।
रोगसूचक हंटिंगटन की बीमारी में हालांकि, 40% सिनेप्स जारी ग्लूटामेट की मात्रा में कमी की प्रवृत्ति के बावजूद, 16 और 58 मिलीसेकंड के बीच TauD मूल्यों का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, TauD को हंटिंगटन रोग में बेकार सिनेप्स के लिए एक बायोमार्कर के रूप में माना जा सकता है, और आगे एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट परिवहन को लक्षित करने वाले प्रयोगों में कार्यात्मक वसूली को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। व्यक्तिगत कोर्टिकोस्ट्रिटल सिनेप्सेस में ग्लूटामेट निगरानी के लिए यह प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के रोगजनकों में ग्लूटामेट तेज की कमी की भूमिका को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है।
एकल सिनेप्स इमेजिंग उत्तेजक सिनेप्स की पूर्व-सिनेप्टिकल साइटों की खोज के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
