Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК
Chapters
Summary November 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Макрофаги, особенно первичные макрофаги, являются сложными для трансфекта, поскольку они специализируются на обнаружении молекул несобственного происхождения. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды.
Transcript
электронный звон Потому что макрофаги специализируются на обнаружении молекул не-саморождения, они особенно трудно трансфект. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с помощью мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Основным преимуществом нашего метода является то, что высокие показатели трансинфекции достигаются при отсутствии какой-либо обнаруживаемой цитотоксичности или иммуногенности.
Демонстрация процедуры будет Марк Херб postdoc из моей лаборатории. Начните с оттаивания всех компонентов комплекта транскрипции РНК. Вихрь реагентов в течение пяти секунд и спина их вниз в течение двух секунд на 2000 раз г, а затем держать их на льду до использования.
Подготовь реакцию транскрипции РНК в микроцентрифуге в 0,5-микролитерной трубке в соответствии с рукописными указаниями. Вихрь трубки и спина его вниз. Затем инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут при смешивании при 400 об/мин на тепловом миксере.
После инкубации добавьте два микролитров DNase I непосредственно в смесь реакции. Вихрь и спина трубки вниз, и инкубировать его в тепловой смеситель еще 15 минут. Зарезервировать двухмиберный алицит продукта, обработанного Dnase, для контрольного геля и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для хвостохранилища полиА добавьте пять микролитров буфера реакции полимеразы 10X polyA и пять микролитров полимеразы полиА в реакцию, обработанную Dnase. Vortex и спина вниз смесь. Затем инкубировать его в термальный миксер в течение 30 минут.
Когда реакция будет завершена, возьмите алицит с двумя микролитровами для контрольного геля и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 5-премьер-реагенты дефофорилирования непосредственно к хвостохранилищу полиА в соответствии с рукописными указаниями. Вихрь и спина вниз трубки, и инкубировать его в тепловой смеситель еще 30 минут.
Следуйте реакции дефосфорилирования с двухминутной инкубацией при температуре 80 градусов по Цельсию, чтобы нагреть инактивацию антарктической фосфатазы. Затем очистите транскрибированную мРНК в пробирке с помощью специального комплекта для очистки РНК. Измерьте концентрацию и чистоту элевированной мРНК с помощью микротомного спектрофотометра.
Вы запустите денатурированный гель агарозы с ранее собранными алицитами, чтобы проверить наличие одного продукта, правильную длину транскрипта и полиа хвостохранилище. Приготовьтесь к трансфекции, добавив предварительно рассчитанный объем буфера трансфекции мРНК за вычетом объемов трансфектного реагента мРНК и мРНК в реакционной трубке. Оттепель мРНК бульон и смешать его осторожно, листая трубку.
Затем добавьте предварительно рассчитанный объем мРНК в реакционной трубке. Vortex и спина вниз реакции смеси и мРНК трансфекции реагент, а затем добавить соответствующий объем мРНК трансфекции реагент реакции смеси трубки. Вихрь трубки и спина его вниз.
Затем инкубировать его при комнатной температуре в течение 15 минут. Тем временем замените культурную среду макрофагов свежей теплой культурной средой. После того, как инкубация трансфекции смесь завершена, добавить смесь пластины скважин, содержащих макрофаги dropwise и по кругу снаружи до середины колодца.
Для обеспечения равномерного распределения трансфекции смесь аккуратно раскачивает пластину в вертикальном и горизонтальном направлении. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа, по крайней мере шесть часов. После инкубации проанализируйте эффективность трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии, цитометрии потока или иммуноблот.
Наиболее важной частью этой процедуры является обеспечение равномерного распределения трансфектной смеси таким образом, чтобы все макрофаги соедеяли с одинаковым количеством мРНК. Этот протокол был успешно использован для генерации вариантов NEMO и IKK-бета с метками FLAG для трансфекции первичных макрофагов. Правильный размер и полиА хвостохранилище мРНК было проверено электрофорезом агарозного геля.
Эффективность трансфекции была подтверждена путем генерации мРНК, кодирующей GFP, и проведения анализа цитометрии потока. Скорость трансфекции увеличилась вместе с количеством трансфицированных мРНК, достигнув 50-65% для ТЧ и от 80 до 85% для BMDM. Как в ТЧ, так и в БМДМ уровень экспрессии ЭГПП в трансфицированных клетках увеличивался во времени и в зависимости от дозы.
Важно отметить, что анализ пропидия йодида-положительного или приложение V-положительных макрофагов подтвердил, что процедура трансфекции не вызывает литик или апоптотической смерти клеток. Эффективность трансфекции мРНК, кодирующих варианты Nemo или IKK-beta с тегами FLAG, были проанализированы с помощью иммунофлюоресценции микроскопии. Тарифы составили около 60% для Nemo mRNAs и 55% для IKK-бета mRNAs.
Этот протокол также использовался для генерации мРНК-кодирования рекомбиназы Cre. Трансфекция 400 000 BMDM с 400 нанограммами Cre recombinase mRNA привела к почти полному истощению белка Немо через 48 часов, что свидетельствует о высокоэффективной трансфекции. Отсутствие каких-либо обнаруживаемых количеств бета Interleukin 1, Интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли указывает на то, что процедура трансфекции не активирует провоспалительные сигналы.
Наш относительно простой метод, наконец, позволяет эффективно выражать мутировавшие или помеченные белки в первичных макрофагах. Это существенно еще больше еще больше далее анализ функций макрофагов на молекулярном уровне.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
