Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Questo metodo cattura le interazioni proteiche transitori in organismi come batteri e lieviti e in diversi tipi di cellule. Qui monitoriamo complessi di chaperone specifici formati transitoriamente che sono coinvolti nella proteostasi cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di generare informazioni sulla dinamica e localizzazione subcellulare degli assemblaggi proteici nelle cellule procariotiche ed eucariotiche.

Adattamenti di questa tecnica in organismi unicellulari come batteri e lieviti, consente ai ricercatori di utilizzarla come un potente strumento per indagare malattie legate alle infezioni microbiche. Questa tecnica potrebbe potenzialmente essere utilizzata per analizzare le interazioni proteiche in quasi tutti gli organismi semplicemente cambiando le condizioni nella fase di preparazione del campione del protocollo. È importante selezionare anticorpi di buona qualità specifici e testati in immunoistochimica, immunofluorescenza, ELISA o immunoprecipitazioni.

Inizia pretrattando diapositive diagnostiche a 10 po ‘con poli-L-lisina. Aggiungere 100 microlitri di 0,0001%poli-L-lisina sterile e filtrato ad ogni pozzo e incubare i vetrini per 30 minuti in una cappa sterile a flusso laminare. Quindi, lavare ogni bene con 50 microlitri di acqua sterile per rimuovere la poli-L-lisina in eccesso.

Aggiungere circa 15.000 cellule per pozzo a seconda del tipo di cellula e far crescere le cellule in un incubatore umido sterile a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% a una confluenza dal 60 all’80%. Dopo 24 ore, rimuovere il mezzo di crescita posizionando una carta velina sul bordo di ogni pozzo e lavare le cellule tre volte con 50 microlitri di PBS. Quindi fissare le cellule aggiungendo 50 microlitri di paraformaldeide al 4% preparata al momento in PBS a ciascun pozzo e incubando lo scivolo a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo la fissazione, lavare la diapositiva tre volte immergendo la diapositiva in un barattolo di colorazione a scorrimento con PBS. Per permeabilizzare le membrane delle cellule attaccate, immergere lo scivolo in 100 millilitri dello 0,5%Triton-X100 in PBS e incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le diapositive tre volte in TBS-T.

Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere il tampone in eccesso con una carta velina. Far crescere e diluire le cellule di S.cerevisiae secondo le indicazioni manoscritte, quindi trasferirle in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e pellet per centrifugazione a 665 volte g per tre minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in cinque millilitri di mezzo fresco.

Quindi aggiungere 550 microlitri di formaldeide al 37% per una concentrazione finale del 4% e incubare la coltura a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le cellule. Dopo l’incubazione, pelletare le cellule, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di paraformaldeide appena preparata nel tampone di lavaggio. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 45 minuti.

Nel frattempo, preparare le diapositive diagnostiche aggiungendo 100 microlitri di soluzione di poli-L-lisina allo 0,0001% ad ogni pozzo e incubando i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare via l’eccesso di poli-L-lisina con acqua ultrapura e lasciare asciugare all’aria gli scivoli. Dopo la fase di incubazione, lavare le cellule due volte con un millilitro di tampone di lavaggio per centrifugazione.

Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule nel tampone di lavaggio. Pellet le cellule dopo l’ultimo lavaggio, e rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio contenente 1,2 sorbitolo molare. Per digerire la parete cellulare, pellettizzare nuovamente le cellule e rimosogliere le cellule in 250 microlitri di soluzione di lyticase appena preparata.

Incubare le cellule a 30 gradi Celsius per 15 minuti con tremori delicati. Dopo la fase di digestione, lavare le cellule tre volte nel tampone di lavaggio e rimorsi le cellule in 250 microlitri di tampone di lavaggio contenente sorbitolo molare 1,2. Aggiungere 20 microlitri di celle riassi sospese a ciascun pozzo rivestito in poli-L-lisina e lasciare che le celle fisse e permeabili si colleghino per 30 minuti.

Lavare i pozzi tre volte con 50 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere le cellule non aderenti e procedere con il saggio di legatura di prossimità. Avviare il saggio di legatura di prossimità, o protocollo PLA, aggiungendo una goccia del buffer di blocco a ciascun pozzo e incubare lo scivolo in una camera umida per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere il tampone di blocco posizionando una carta velina sul bordo di ogni pozzo e lavare le cellule due volte in 100 millilitri di tampone di lavaggio A.Successivamente, aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale primaria a ciascun pozzo e incubare lo scivolo per 60 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umida.

Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare gli scivoli due volte nel tampone di lavaggio A.Dopo il lavaggio, aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo e incubare lo scivolo per 60 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umida. Quindi rimuovere la soluzione e lavare le diapositive due volte nel tampone di lavaggio A.Quindi aggiungere 40 microlitri della miscela di legatura del DNA che contiene oligonucleotidi del connettore e ligasi del DNA, ad ogni pozzo, e incubare lo scivolo nella camera umida a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l’incubazione, rimuovere la miscela di legatura e lavare gli scivoli due volte con tampone di lavaggio A.Aggiungere 40 microlitri della miscela di amplificazione del DNA che contiene la DNA polimerasi e gli oligonucleotidi etichettati fluorescentmente ad ogni pozzo e incubare per 100 minuti nella camera umida a 37 gradi Celsius.

Rimuovere la miscela di amplificazione e lavare gli scivoli in 100 millilitri di tampone di lavaggio B per 10 minuti per lavaggio. Quindi lavare gli scivoli in 100 millilitri di tampone di lavaggio B diluito da uno a 100 in acqua ultrapura. Aggiungere 20 microlitri di supporto contenente DAPI per pozzo.

Coprire i pozzali dello scivolo con uno scivolo di copertura e sigillare con smalto per unghie. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per monitorare gli assemblaggi di chaperone transitori formati tra distinte proteine del dominio J e proteine del chaperone Hsp70 e del dominio J nelle cellule HeLa, S.cerevisiae ed E.coli. Le proteine del dominio J di classe A e B sono state prese di mira con anticorpi primari altamente specifici.

Ognuno dei puncti fluorescenti rossi rappresenta un complesso proteico formato tra due distinte proteine del dominio J nelle cellule HeLa. Complessi proteici simili di classe J di classe J sono osservati anche nell’eucariota unicellulare S.cerevisiae, o lievito del fornaio. Alcuni dei puncti fluorescenti generati dal PLA erano più difficili da risolvere come singoli focolai, a causa delle piccole dimensioni delle celle.

La formazione complessa tra le proteine del dominio J di classe A e B non è stata osservata nelle cellule E.coli, il che è coerente con gli studi biochimici eseguiti con proteine purificate. Ma altri assemblaggi di chaperone che coinvolgevano proteine del dominio J e il chaperone Hsp70 furono catturati usando il protocollo PLA. I controlli tecnici privi di un anticorpo primario contro una delle proteine o degli accompagnatori del dominio J interagenti nelle reazioni PLA altrimenti complete mostravano poca o nessuna formazione di puncti a fluorescenza nelle cellule, indicando una mancanza di falsa amplificazione del segnale positivo.

Per ottenere risultati affidabili utilizzando il saggio di legatura di prossimità, verificare preventivamente che gli anticorpi utilizzati siano di qualità sufficiente. Inoltre, prendere precauzioni per evitare la sovragestione delle cellule contenenti una parete cellulare.