В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

Этот метод фиксирует переходные белковые взаимодействия в организмах, таких как бактерии и дрожжи, а также в различных типах клеток. Здесь мы отслеживаем временно сформированные специфические комплексы сопровождающего, которые участвуют в клеточном протеостазе. Основным преимуществом этого метода является способность генерировать информацию о динамике и субклеточной локализации белковых сборок в прокариотических и эукариотических клетках.

Адаптация этого метода в одноклеточных организмах, таких как бактерии и дрожжи, позволяет исследователям использовать его в качестве мощного инструмента для исследования заболеваний, связанных с микробными инфекциями. Этот метод потенциально может быть использован для анализа белковых взаимодействий почти во всех организмах путем простого изменения условий на этапе подготовки образца протокола. Важно выбрать антитела хорошего качества, которые являются специфическими и протестированы либо в иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, ELISA, или иммунопреципиетации.

Начните с предварительного лечения 10-хорошо диагностических слайдов с поли-L-лизин. Добавьте 100 микролитров стерильных и отфильтрованных 0.0001%поли-L-лизина к каждой хорошо, и инкубировать слайды в течение 30 минут в стерильной ламинарной капюшон потока. Затем промойте каждый колодец 50 микролитров стерильной воды, чтобы удалить избыток поли-L-лизина.

Добавьте приблизительно 15 000 клеток на колодец в зависимости от типа клетки и выращивайте клетки в стерильном влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом до 60-80% стечения. Через 24 часа, удалить рост среды, поставив бумагу на краю каждой хорошо, и мыть клетки три раза с 50 микролитров PBS. Затем исправить клетки, добавив 50 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde в PBS к каждому хорошо и инкубации слайд при комнатной температуре в течение 10 минут.

После фиксации, мыть слайд три раза, погружая слайд в слайд-окрашивание банку с PBS. Чтобы пронизать мембраны прикрепленных клеток, погрузите слайд в 100 миллилитров 0,5%Triton-X100 в PBS, и инкубировать клетки в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем мыть горки три раза в TBS-T.

После последней стирки удалите лишний буфер салфеткой. Выращивайте и разбавляйте клетки S.cerevisiae в соответствии с рукописными указаниями, затем перенесите их в 50-миллилитровую центрифугу и гранулы центрифугированием при 665 раз г в течение трех минут. Удалите супернатант и повторно наполнить клетки в пять миллилитров свежей среды.

Затем добавьте 550 микролитров 37%формальдегида для окончательной концентрации 4% и инкубировать культуру при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы исправить клетки. После инкубации, гранулы клетки, удалить супернатант, и повторно гранулы в один миллилитр свежеприготовленных 4%paraformaldehyde в буфер для мытья. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 45 минут.

Между тем, подготовить диагностические слайды, добавив 100 микролитров 0,0001%поли-L-лизин решение для каждой хорошо и инкубации слайдов в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем смойте излишки поли-L-лизина ультрачистой водой и дайте слайдам высохнуть. После инкубации шаг, мыть клетки в два раза с одним миллилитр мыть буфер центрифугации.

Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в буфер для мытья. Пеллет клетки после последнего мытья, и удалить супернатант и повторного незаменимия клеток в один миллилитр мыть буфера, содержащего 1,2 молярного сорбитола. Чтобы переварить клеточной стенки, гранулы клетки снова и повторного незаменимых клеток в 250 микролитров свежеприготовленного раствора Lyticase.

Инкубировать клетки при 30 градусах по Цельсию в течение 15 минут с нежной тряской. После шага пищеварения, мыть клетки три раза в буфер мытья и повторного перерасхода клеток в 250 микролитров мыть буфера, содержащего 1,2 молярного сорбитола. Добавьте 20 микролитров повторно подвешенных клеток к каждому хорошо покрытому поли-L-лизином, и позвольте фиксированным и проницаемым клеткам прикрепиться в течение 30 минут.

Вымойте скважины три раза с 50 микролитров буфера мытья, чтобы удалить неприемляемые клетки, и приступить к анализу перевязки близости. Инициировать анализ перевязки близости, или протокол НОАК, добавив каплю блокирующего буфера к каждой колодец и инкубировать слайд во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. Удалите блокирующий буфер, поместив бумагу на краю каждой хорошо, и мыть клетки дважды в 100 миллилитров мыть буфера A.Next, добавить 40 микролитров первичного раствора антител к каждой хорошо, и инкубировать слайд в течение 60 минут при 37 градусов по Цельсию во влажной камере.

Удалить первичный раствор антитела и мыть слайды дважды в буфер мыть A.After мытья, добавить 40 микролитров вторичного раствора антитела к каждой хорошо и инкубировать слайд в течение 60 минут при 37 градусов по Цельсию во влажной камере. Затем удалите раствор и мыть слайды дважды в буфер мыть A.Then добавить 40 микролитров смеси перевязки ДНК, которая содержит разъем олигонуклеотидов и ДНК лигазы, к каждому хорошо, и инкубировать слайд во влажной камере при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации, удалить смесь перевязки и мыть слайды дважды с мытья буфера A.Add 40 микролитров смеси усиления ДНК, которая содержит полимеразы ДНК и флуоресцентно помечены олигонуклеотидов к каждой хорошо, и инкубировать в течение 100 минут во влажной камере при 37 градусов по Цельсию.

Удалить смесь усиления и мыть горки в 100 миллилитров мыть буфера B в течение 10 минут за стирку. Затем промыть горки в 100 миллилитров мыть буфера B разбавленной от одного до 100 в ультрапурной воде. Добавьте 20 микролитров DAPI-содержащей монтажной среды на колодец.

Обложка скважин слайда с крышкой скольжения и уплотнения с лаком для ногтей. Этот протокол был успешно использован для мониторинга переходных сборок сопровождающего, образованных между различными белками J-домена и белками Hsp70 и J-домена в клетках HeLa, S.cerevisiae и E.coli. Белки класса А и класса B J-домен были нацелены на высокоспецифические первичные антитела.

Каждый из красных флуоресцентных панкти представляет собой белковый комплекс, образованный между двумя различными белками J-домена в клетках HeLa. Аналогичные белковые комплексы смешанного класса J-domain также наблюдаются в одноклеточном эукариоте S.cerevisiae, или хлебопекарных дрожжах. Некоторые из флуоресцентных puncti порожденных от НОАК было труднее решить, как отдельные очаги, из-за небольшого размера клеток.

Комплексное образование белков класса А и В J-домен не наблюдалось в клетках E.coli, что согласуется с биохимическими исследованиями, проведенными с очищенными белками. Но другие сборки сопровождающего с участием J-доменных белков и сопровождающего Hsp70 были захвачены с помощью протокола НОАК. Технический контроль, не хватает первичного антитела против одного из взаимодействующих J-домен белков или chaperones в противном случае полные реакции НОАК показали мало или в отсутствие образования флуоресценции puncti в клетках, что свидетельствует об отсутствии ложноположительного усиления сигнала.

Чтобы получить достоверные результаты с помощью анализа перевязки близости, заранее убедитесь, что используемые антитела достаточного качества. Кроме того, принять меры предосторожности, чтобы избежать чрезмерного переваривания клеток, содержащих клеточной стенки.