Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifisering av koenzym A i celler og vev
Chapters
Summary September 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne metoden beskriver prøven forberedelse fra kultivert celler og animalsk vev, ekstraksjon og derivatization av koenzym A i prøvene, etterfulgt av høytrykks væske kromatografi for rensing og kvantifisering av derivatized koenzym A ved absorbansen eller fluorescens deteksjon.
Transcript
Koenzym A, kalt CoA for kort, er en viktig kofaktor i cellulær metabolisme. Kvantitative målinger avslører endringer som skjer med ernæringsmessige og hormonelle tilstander i dyremodeller. Denne metoden kvanterer den totale mengden cellulær CoA, inkludert CoA-derivater og gratis CoA, i en enkel, pålitelig metode.
Flere typer nevrodegenerasjon med hjernejernakkumulering er forbundet med mutasjoner i genene til CoA biosyntetisk vei. Denne metoden kan brukes på ethvert biologisk system siden alle organismer krever CoA for overlevelse, vekst og funksjon. En førstegangsforsker kan slite med de første trinnene i prøveforberedelsen, hvor det er viktig å holde prøvene helt kalde og deretter raskt overføre dem til kaliumhydroksid.
Begrens antall prøver i en batch før overføring til kaliumhydroksid, og øv med overføringen før du arbeider med eksperimentelle prøver. Mange forskere er ikke kjent med solid faseutvinning i utarbeidelsen av biologiske prøver for senere biokjemisk analyse. Til å begynne med inkubere triplicate kulturretter parallelt, to for biokjemisk analyse og en for bestemmelse av levedyktig cellenummer.
Når kulturen nærmer seg de sene subconfluent tettheter, for eksempel, menneskelige HepG2 / C3A celler vokst til en tetthet på seks til åtte ganger 10 til de seks eller HEK 293T celler vokst til en tetthet på ca 1,3 ganger 10 til syv per 100-millimeter parabolen, høste de vedleverske cellene i kulturen. Deretter legger du til en milliliter iskaldt vann til samme kulturrett. Skrap celler i det kalde vannet i fatet, og overfør cellesuspensjonen til et glassprøverør som inneholder 400 mikroliter på 0,25-molar kaliumhydroksid og 1,5 milliliter vann for å bringe pH over 12.
Bland suspensjonen kraftig ved å virvle høyt i 10 sekunder. Dekk deretter tett med parafinfilm, og inkuber ved 55 grader Celsius i en time uten å riste i et vannbad. Deretter legger du til 160 mikroliter med en-molar Trizma-hydrokloridløsning og 10 mikroliter på 100 ml mBBr.
Bland ved å virvle høyt i 10 sekunder. Dette bringer pH til ca åtte for å støtte mBBr-reaksjonen med gratis CoA. Dekk røret med parafinfilm, og inkuber prøvene ved romtemperatur i to timer i mørket for mBBr å reagere med thiol av CoA.
Etter to timer, tilsett 100 mikroliter eddiksyre, og bland ved vortexing i 10 sekunder for å stoppe reaksjonen. En nedbør dannes i røret. Deretter sentrifuge på 2, 000 ganger g i 15 minutter.
For å fjerne de utfelte celleavfallene, overfør og lagre supernatanten i et glassprøverør for opprydding av fastfaseekstraksjonskolonnen. Før analysen startet, tilsett to milliliter med en millimolar kaliumhydroksid til et glass reagensrør designet for innsetting av en sonde og vev forstyrrelse med en rotor-stator homogenisator. Hold røret på is til bruk.
Vei de frosne vevsbitene raskt, og registrer den våte vekten for hver prøve. Overfør vevet inn i glassrøret, og homogeniser vevet i 30 sekunder. Unngå fullstendig tining av vevet.
Tilsett 500 mikroliter med 0,25-molar kaliumhydroksid. Vortex på høy i 10 sekunder, og holde på isen. Dette bringer pH av prøven over 12 for å hydrolysere CoA-tørstene for å gi total CoA.
Dekk røret med parafinfilm. Utarbeidelsen av kultiverte celler og fremstilling av vev er de mest kritiske trinnene i denne prosedyren. Det er viktig å legge til høy kaliumhydroksid raskt for å forhindre CoA-nedbrytning.
Inkuber prøvene ved 55 grader Celsius i to timer i et vannbad uten å riste for å støtte hydrolyse. Deretter legger du til 150 mikroliter med en-molar Trizma-hydroklorid og 10 mikroliter på 100-millimolar mBBr for å bringe pH til omtrent åtte for å støtte mBBr-reaksjonen med gratis CoA. Vortex på høy i 10 sekunder.
Dekk røret med parafinfilm, og inkuber prøvene ved romtemperatur i to timer i mørket for å sikre at all CoA er derivatisert med mBBr. Deretter legger du til 100 mikroliter eddiksyre, og vortex på høy i 10 sekunder for å stoppe reaksjonen. Sentrifuge ved 2000 ganger g i 15 minutter for å pellet utfelt celleavfall, og overføre supernatanten til et glassreagensrør for opprydding av massivfaseekstraksjonskolonnen.
Ved romtemperatur, likevekt hver en-milliliter disponibel 2-2-pyridyl-etyl silika gel kolonne med en milliliter vaskebuffer for å sikre at pyridyl funksjonell gruppe er protonert og vil fungere som en anion veksler. Deretter pipette prøven supernatant på kolonnen, og samle eluate. Vask kolonnen to ganger med en milliliter vaskebuffer og en gang med en milliliter vann for å fjerne eventuelle uopphetede arter.
Deretter, inn i et eget glassprøverør, vask kolonnen to ganger med en milliliter elutionbuffer for å samle CoA-bimane. Tørk CoA-bimane prøven i røret under nitrogengass. Forsegle, helt dekke røret, og lagre på minus 20 grader Celsius.
Når du er klar for HPLC-analyse, bruker du prøven på 300 mikroliter vann, og bland kraftig ved å virvle høyt i 10 sekunder. Overfør den gjenbrukte prøven til et sentrifugerørfilter, og sentrifuge ved 5 000 ganger g i 10 minutter for å fjerne eventuelle bunnspapp. Deretter overfører du den filtrerte prøven til et hetteglass med glass som er egnet for HPLC-injeksjon.
I denne studien viser en representativ HPLC-profil oppbevaringstiden til CoA-bimane-standarden i C18 HPLC-kolonnen. Økende mengder av CoA-bimane-standarden ble injisert individuelt, og områdene under toppene i CoA-bimanekromatrammer ble plottet som en funksjon av input CoA-bimane. Standardkurven reflekterte størrelsen på absorbansen av CoA-bimane ved en bølgelengde på 393 nanometer.
Fluorescensen av CoA-bimane ble også reflektert ved eksitasjonsbølgelengden på 393 nanometer og utslippsbølgelengde på 470 nanometer. Påfølgende HPLC-separasjon og typiske deteksjonsprofiler for muselever- eller menneskekulturerte C3A-celler indikeres her med røde topper, med en oppbevaringstid mellom 11 og 12 minutter ved hjelp av elutionprogrammet. Hvis reaksjonen med mBBr ikke gir påviselige resultater, kan det hende at mengden Trizma-HCl må justeres for å senke pH-en til omtrent åtte.
Det er mulig å oppdage flere cellulære molekyler som inneholder sulfhydryl eller tioester moieties som bimane derivater. Glutation-bimane kan for eksempel oppdages med HPLC-metoden. Denne teknikken vil tillate andre forskere å undersøke den potensielle rollen coa dysfunksjon forbundet med metabolsk ubalanse, som dyremodeller av type 2 diabetes.
Forskere bør bruke personlig verneutstyr når de arbeider med organiske løsemidler som brukes til solidfaseutvinning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
