Neuroscience
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एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना
Chapters
Summary August 28th, 2019
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यहाँ हम organelles के intracellular परिवहन और murine astrocytes में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी कल्पना करने के लिए एक इन विट्रो लाइव-इमेजिंग विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल भी कार्गो परिवहन itineraries और गतिकी का निर्धारण करने के लिए एक छवि विश्लेषण पद्धति प्रस्तुत करता है।
Transcript
हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग नियंत्रित बाह्राश वातावरण और हल्के रोग राज्यों के तहत एस्ट्रोसाइटिक ऑर्गेनेल्स या प्रोटीन की गतिशीलता और स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जा सकता है। गृह मंत्रालय की निश्चित तैयारी के विपरीत, जो प्रोटीन और ऑर्गेनेल स्थानीयकरण के एकल स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, हमारी लाइव इमेजिंग तकनीक का उपयोग व्यक्तिगत लाइव एस्ट्रोसाइट्स में कण गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। ट्रांसफैक्शन के बाद 24 से 48 घंटे पर इमेजिंग के लिए उपयुक्त घनत्व पर ट्रांसफैक्शन बीज एस्ट्रोसाइट्स से पहले दिन।
कम सीरम माध्यम में लिपोफेक्शन रीएजेंट को उचित प्रयोगात्मक एकाग्रता तक पतला करें। कम सीरम माध्यम के २५० माइक्रोलीटर में उच्च शुद्धता डीएनए के पांच माइक्रोग्राम पतला और ट्यूब के लिए लिपिखंड बढ़ाने वर्धक अभिकर्ण के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें । लिपोफेक्शन रीएजेंट को डीएनए लिपोफेक्शन वर्धक मिक्स की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए समाधान को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के अंत में एस्ट्रोसाइट कल्चर से सुपरनेट निकालें और कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन मिक्स ड्रॉपवाइज के 100 माइक्रोलीटर डालें। ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर छह घंटे के बाद, एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम की एक उपयुक्त मात्रा के साथ ट्रांसफेक्शन परिसर की जगह और एक अतिरिक्त 24 से ७२ घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को वापस । इमेजिंग से 30 मिनट पहले एस्ट्रोसाइट कल्चर मीडियम के 200 माइक्रोलीटर में एक उपयुक्त लिसोसोमल लेबलिंग जांच को एक माइक्रोमोलर की वर्किंग कंसंट्रेशन के लिए पतला करें और एस्ट्रोसाइट्स को 30 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच के साथ लेबल करें।
फिर कोशिकाओं को एक बार गर्म एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम से धोएं और वॉश को इमेजिंग माध्यम से बदलें। जांच लेबलिंग के तुरंत बाद, एस्ट्रोसाइट कल्चर कंटेनर को माइक्रोस्कोप चरण पर उपयुक्त एडाप्टर में रखें और ईबीआई फ्लोरेसेंस लाइट का उपयोग करके, फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जांच व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का पता लगाएं। चयनित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट नमूना रोशनी को समायोजित करने के लिए डिजिटल कैमरे का उपयोग करें और ध्यान को समायोजित करें और एक ही सेल में ज़ूम करें।
फिर 300 और 500 सेकंड के बीच के समय अंतराल के लिए हर दो सेकंड में एक फ्रेम की आवृत्ति पर एक जेड-स्टैक टाइम-लैप्स श्रृंखला प्राप्त करने के लिए ज़ूम और निश्चित फोकस कार्यों का उपयोग करें। AVI या झगड़ा ढेर फ़ाइलों के रूप में समय चूक छवियों को सहेजें और निर्यात करें। समय-चूक छवियों का विश्लेषण करने के लिए, इमेजजे या फिजी में समय-चूक छवि अनुक्रम खोलें और चैनलों को विभाजित करने के लिए स्प्लिट चैनल टूल का उपयोग करें।
आठ बिट ग्रीन चैनल छवि में, सभी फिल्मों के लिए एक ही वांछित दिशात्मक सम्मेलन का उपयोग करके कणों के प्रक्षेप-पथ के साथ एक लाइन का पता लगाने के लिए खंडित लाइन टूल का उपयोग करें ताकि ध्रुवता अध्ययन की जा रही सभी कोशिकाओं के भीतर और पार सुसंगत हो। ट्रैक की मोटाई से मेल खाने के लिए लाइन की चौड़ाई को समायोजित करने के लिए लाइन टूल पर डबल क्लिक करें और 10 की लाइन चौड़ाई का उपयोग करके Kymo टूलबॉक्स प्लगइन के ड्रा काइमो मैक्रो को चलाएं। समय और स्थान में छवि को जांचने के लिए एक संकेत दिखाई देगा।
एक बार कैलिब्रेट होने के बाद, काइमोग्राफ उत्पन्न हो जाएंगे और झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजे जा सकते हैं। कण प्रक्षेप पथ आवंटित करने के लिए, अधिग्रहण की पूरी अवधि के लिए केमोग्राफ में प्रत्येक कण को मैन्युअल रूप से ट्रैक करने के लिए खंडित लाइन टूल का उपयोग करें और प्रत्येक कण प्रक्षेपवक्र को रुचि के क्षेत्र के रूप में रिकॉर्ड करने के लिए आरओआई प्रबंधक का उपयोग करें। आगे के विश्लेषण के लिए हर बार-चूक वीडियो के अनुसार ब्याज के सभी क्षेत्रों को बचाएं और काइमो टूलबॉक्स प्लगइन के विश्लेषण काइमो मैक्रो को चलाएं।
एक खिड़की ड्रॉपडाउन मेनू से ब्याज की कोशिका के नाभिक से कण गति की जावक दिशा को परिभाषित करने के लिए पूछ खोलेगी। सीमा गति ब्याज के प्रत्येक कार्गो के लिए सॉफ्टवेयर की संवेदनशीलता के अनुसार परिभाषित किया जाना चाहिए और लाइन चौड़ाई प्रत्येक कण प्रक्षेपवक्र की मोटाई मैच के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । लॉग ऑल डेटा और लॉग एक्सट्रपलेटेड निर्देशांक विभिन्न कार्गो परिवहन मापदंडों की गणना के लिए होना चाहिए।
ठीक है क्लिक करें। इसके बाद व्यक्तिगत पटरियों के लिए गणना किए गए डेटा को प्रति किमोग्राफ जमा किया जाएगा और प्रत्येक छवि के लिए विशिष्ट टेक्स्ट फाइलों में सेव किया जाएगा। मिलाते हुए आधारित शुद्धिकरण रणनीति के साथ साइटोसाइन अरबिनोसाइड उपचार का संयोजन पारंपरिक प्रोटोकॉल पर एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की शुद्धता को समृद्ध करता है जिसमें केवल शुद्धिकरण कदम शामिल है।
लिपोफेक्शन आधारित ट्रांसफैक्शन उन स्तरों पर प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति की अनुमति देता है जो विषाक्तता पैदा किए बिना या एस्ट्रोसाइट व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना लाइव सेल इमेजिंग के लिए इष्टतम हैं। इसी तरह, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग ऑर्गेनेल गतिशीलता और एस्ट्रोसाइट्स की ट्रैकिंग के लिए अम्लीय एंडोलिसोसोमल ऑर्गेनेल्स की तेजी से और कुशल लेबलिंग की अनुमति देता है। इमेजिंग से समय-चूक डेटा का उपयोग समय और स्थान में कार्गो गति को ट्रैक करने वाले का्योग्राफ उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।
इन केमोग्राफ में, इंगित कार्गो के एंटेरोग्रेड आंदोलन को नकारात्मक ढलानों के साथ प्रक्षेप पथ द्वारा दर्शाया जाता है, जबकि प्रतिगामी आंदोलन का प्रतिनिधित्व सकारात्मक ढलानों के साथ प्रक्षेप पथ द्वारा किया जाता है। स्थिर वेसिकल्स ऊर्ध्वाधर प्रक्षेप पथ के रूप में दिखाई देते हैं। इस विश्लेषण में, एस्ट्रोसाइट के एक क्षेत्र के माध्यम से एक विशिष्ट कार्गो के प्रवाह की मात्रा में कार्गो के बीच मोडल कणों के प्रतिशत में अंतर का पता चला है जो एस्ट्रोसाइट के क्षेत्र में उनके सामान्य आधार रेखा गतिशीलता के संभावित प्रतिनिधि हैं, जिसके भीतर फिल्में प्राप्त की गई थीं।
कामोग्राफ से प्राप्त प्रत्येक कण के लिए पूर्ण टाइमस्केल के साथ एक्स, वाई स्थिति में परिवर्तन की सटीक मानचित्रण का उपयोग कार्गो वेग और रन लेंथ जैसे अन्य गति मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है। चूंकि इस प्रोटोकॉल में उच्च गुणवत्ता वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों और कुशल कार्गो लेबलिंग की आवश्यकता होती है, इसलिए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट इनक्यूबेशन समय और अधिग्रहण समय को प्रत्येक प्लाज्मिड या ब्याज के कार्गो के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल को कोशिका क्षति, विषाक्तता, रोगजनक उत्परिवर्तन, सिनैप्टिक गतिविधि, या अंतर या बाह्य पर्यावरण में परिवर्तन के जवाब में एस्ट्रोसाइट्स में परिवहन घटनाओं की विशेषता के लिए संशोधित किया जा सकता है।
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