Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Billeddannelse og analyse af vævsorientering og vækstdynamik i udvikling af Drosophila Epithelia under pupalfaser
Chapters
Summary June 2nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol er designet til billeddannelse og analyse af dynamikken i celleorientering og vævsvækst i Drosophila abdominal epithelia som frugtfluen gennemgår metamorfose. Den metode, der er beskrevet her, kan anvendes til undersøgelse af forskellige udviklingsstadier, væv og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modelorganismer.
Transcript
Inden for flercellede organismer viser væv høje grader yderligere i deres rumlige orientering. Celler justere og vise en række prioritet over store afstande i løbet af morfogenese. For at forstå, hvordan planar arrangementer af epithelia nås under udviklingen, er det afgørende at spore celle's orienteringer og vækstdynamik med høj spacial tidsmæssig troskab in vivo.
Den beskrevne protokol er designet til at afbilde og analysere celleadfærd på globalt og lokalt plan i drosophila pupal epidermis. Denne metode kan give indsigt i forskellige teori om forskning, cellebiologi, morfogenese, og planar polaritet og kan anvendes til analyse af andre væv, strukturer og modeller. Alle trin kan udføres nemt efter nogle praksis.
De kræver præcision. Visualisering af denne protokol hjælper med at opnå optimale resultater på kortere tid. Den pupal dissektion er kompleks.
Til at begynde, bruge en fugtet pensel til at overføre iscenesat hvid pre-pupper til en frisk plast hætteglas, og holde dem der så længe det er nødvendigt ved 25 grader Celsius. Fjern derefter hver pupper fra væggen af hætteglasset ved hjælp af stævle. Lim den ventrale side af hver pupper på et glas dias dækket med dobbeltsidet tape.
Tryk forsigtigt på hovedet spiracles og dorsale overflade af puppen med spidsen af de virbe at sikre vedhæftning af pupal sagen til båndet. Begynd dissektion under et stereomikroskop ved forsigtigt at fjerne operculum fra puparium med snævler. Indsæt en spids af snævlene i en lavvandet mellem pupal sagen og pupper overfladen gennem operkulær åbning.
Riv sagen fra hoved til hale sideom side i en eller flere gynger, undgå klemme puppen. Fold tilbage krakket pupal sagen til laterale sider, som du holder fortsætter til den bageste ende. Fjern puppen fra den åbnede op pupal sagen ved omhyggeligt at indsætte snævle under dyret og forsigtigt trække op.
Puppen klæber til spidsen af pincet. Hold puppen forsigtigt ved ventrale side, og overføre puppen til et glas bund fad på toppen af en lille dråbe gas-permeable halocarbon olie. Rul et stykke vådt silkepapir i skålens kanter og dæk skålen til for at opretholde fugten.
Orient puppen over olien dråbe på glasbundet retter i henhold til domænet og den proces, der skal evalueres. For langsigtet levende billeddannelse af den tidlige udvidelse af dorsale reder, dorsal lateral orientere puppen. At billedet deres sene ekspansion og væv remodeling, dorsally orientere puppen.
Overfør glasbundet skål, der indeholder den monterede pupper til mikroskopet fase og fokusere på overfladen af maveregionen ved hjælp af transmitteret lys. At anvende mitotisk rekombination til at fremkalde genetiske mosaikker i abdominal epitel, forberede jomfru hunner bærer en varmechok inducerende flipase, en FRT site på et bestemt genomisk sted, og en genkendelig cellulære markør distalt til FRT site. Forbered mutant hanner bærer en FRT sted på tilsvarende genomisk placering.
Kryds flere hunner og hanner i en tre til en andel i et plastikhætteglas ved 25 grader Celsius i fire til fem dage. For at generere somatiske kloner i histoblasterne udføres varmechokbehandling på den tredje instar larve fase af korsets afkom ved at nedsænke plastikhætteglassene, der indeholder dyrene i et vandbad ved 37 grader Celsius i 45 minutter til en time. I billedet J software, bruge den maksimale intensitet projektion funktion til at beskytte Z stak skiver erhvervet af konfokal mikroskopi i 2D.
Rederne har en karakteristisk form, der orienterer dem i et planar koordinatsystem foran venstre og dorsal til toppen. For at opnå optimale resultater med denne analyse skal inputbilledet anskaffes med høj opløsning. Hvis du vil hente kvalitative orienteringsværdier på lokale cellekanter, skal du klikke på plug-in-menuen og vælge fordelingen af retning J.
Indstil det gaussiske vindue sigma til en pixel, kubisk spline til gradient, minimum sammenhængsgrad til 20 procent og minimum energi til én procent. Anvbet farveundersøgelsen mulighed for plug-in. Indstil farvetone til retning, mætning til sammenhæng og lysstyrke til inputbillede.
Denne farve koder cellekantretninger i forhold til det anede planarkoordinatsystem. Derefter skal du bruge indstillingen Retning J-målretning under plug-in-menuen til at kvantificere celleretninger og retningscelle til cellejustering. Generer små, tilstødende ikke-overlappende regioner af interesse af ensartet vægt omkring 20 mikrometer gange 20 mikrometer i det område, der er besat af histoblaster.
Presserende målpunkt beregner den dominerende lokale orientering og sammenhæng fra ROI'erne. I denne undersøgelse, den anvendte metode er i stand til at generere høj opløsning film af den udviklende pupper i perioder på op til 48 timer uden betydelig foto blegning eller foto toksicitet. Eksempler på vilde type kloner præget af fraværet af RFP NLS og deres dobbelte pletter på 26 timer efter puparium dannelse er vist her.
Klonerne aflange langs segmenternes grænser. Twin kloner arrangeret parallelt eller i tandem. Morfologi af en vild type klon på 26 timer og 47 timer efter puparium dannelse viser komplekse grænse morfologi på begge stadier.
Box og whisker plots for geometriske parametre på 26 timer og 47 timer efter puparium dannelse viser den gennemsnitlige område og omkreds steget betydeligt i denne tid vindue. Klonens orientering blev opretholdt under udvidelse og ombygning. Form parametre på 26 timer og 47 timer efter puparium dannelse angiver ruhed, rundhed og cirkularitet næppe ændret i den vilde type kloner.
Sørg for ikke at beskadige puppen, ellers vil den dø inden for et par timer, hvilket påvirker levende billeddannelse. Denne protokol kræver ikke, at der anvendes sartuseragens eller -instrument. Undgå at klemme dig selv, når du dissekerer.
Ved at anvende disse metoder muligt at generere høj opløsning film i lange perioder ved hjælp af forskellige forestille teknikker. Brænd til foton eller spinning diske. Chloral analyse kan anvendes til at udforske ikke-autonome reaktioner, da tilfældige celler lette i identifikationen af krydssamtaler eller cellekommunikationsmekanismer.
Disse metoder kan let tilpasses til at studere en bred vifte af morfogenetiske fænomener, herunder koordinering af epidermal, muskuløs, og neuro udvikling under metamorfose.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
