Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Abbiategrasso Brain Bank Protokol til indsamling, behandling og karakterisering aldrende hjerner
Chapters
Summary June 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol beskriver en metode til at spore individuelle hjerne-aldring baner gennem en hjernedonation program og korrekt karakterisering af hjerner. Hjernedonorer er involveret i en langsigtet langtidsundersøgelse, herunder serielle flerdimensionale vurderinger. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af hjernens behandling og en nøjagtig diagnostisk metode.
Transcript
Som en neurokognitiv lidelse prævalens er konstant stigende, vores mål er at opnå, karakterisere og gemme kvalitet hjernevæv prøver for at opnå præcis diagnose og kaste lys over de neurodegenerative mekanismer. I betragtning af hjerne assymetri, vores prøveudtagning metode tillader alle meta undersøgelser, der skal udføres på histologisk veldefinerede væv fra begge halvkugler og de mange data kan indsamles og korreleret gennem dyb læring. Additiv effekt på hjerneskade ved flere patologier er ofte observeret.
Den endelige diagnose kræver at kombinere klinisk syndrom med de neuropatologiske fund for at opdage sygdomspatogenese og mulige behandlinger. Friske skæreprocedurer samt makrosektionsstyring er vanskelige, men er også afgørende for at opnå gode resultater. Et trænet og stramt sammentømret team er afgørende for at overvinde disse vanskeligheder.
Vores protokol indeholder en række trin, der kræves pattedyr fingerfærdighed, derfor visuel demonstration kan være mere nyttigt end beskrivende tekster til forsker, der ønsker at mestre disse teknikker. Efter bekræftelse thanatografi, bruge en skarp skalpel til at gøre en hovedbund indsnit gennem håret huden og subkutan væv på koronal pladen fra spidsen af mastoid processen på den ene side til den anden, passerer over vertex. Adskå de to folder i hovedbunden omhyggeligt fra kraniet og fortsætte snittet, indtil den gule super orbital fedt bliver synlig.
Afspejler hovedbunden anteriorly og trække den anden del af væv posteriort. Ved hjælp af en skalpel og scer, høste en lille prøve af den tidsmæssige musklen på hver side af kraniet, placere en prøve i 4% formaldehyd og den anden prøve ved fire grader Celsius. Ved hjælp af en elektrisk sav skære kraniet i en V skåret på frontal side og fjerne kalot.
Efter at have skåret meninges, høste et stykke dura til fiksering og en anden til frysning. Indsæt en 20 gauge 3,5 tommer nål fastgjort til en 10 milliliter sprøjte gennem corpus callosum at nå den tredje ventriklen og trække stemplet for at opnå omkring 10 milliliter cerebral spinalvæske. Vurder udseendet farve og turbiditet af væske og måle pH.
Træk forsigtigt i begge frontlapper for at løfte hjernen og skære både synsnerver infundibulum, de interne halspulsårer og den tredje, fjerde, femte og sjette kranienerver. Skær tentorium at nå den bageste fossa og skære vertebrale arterier og de lavere kranienerver. Derefter indsætte skalpel så dybt som muligt gennem foramen magnum at skære den mest caudal del af medula og omhyggeligt fjerne hele hjernen.
Brug skalpel til at vises til knoglen over Meckel's hule og indsamle Gasserian ganglion fra hver side for fiksering og frysning. Brug en kirurgisk hammer og mejsel til at fraktur den knoklede sella turcica og fjerne hypofysen for fiksering i 4% formaldehyd. Undersøg kraniet og hele hjernen fra makroskopiske ændringer og vaskulære ændringer.
Brug et målebånd til at måle hjernens tværgående og forreste kropsholdningsdiametre og veje hjernen på en skala. Hent forsigtigt cirklen af Willis til makroskopisk vurdering for tilstedeværelsen af anatomiske varianter, læsioner eller karstenose. Adskælg og undersøg cerebrum, lillehjernen og hjernestammen, før vævene vejes individuelt.
Fjern en til to, to til fire centimeter kvadrerede stykker leptomeninges fra konveksitet og bevare prøverne i komplet høj glukose DMEM kultur medium ved fire grader Celsius. Høst pinealkirtlen for fiksering i 4% formaldehyd og fjerne olfaktoriske pærer og synsnerver til fiksering og frysning af en af hvert par. Placer cerebrum, lillehjernen, og hjernestammen på is ved fire grader Celsius.
Når alle væv af interesse er blevet høstet bruge en super klæbende lim til at fastgøre knoglen igen og bruge en kirurgisk nål, og ikke-absorberbare suturer til at sy tilbage hovedbunden. For hjernen bank dissektion bruge en dissekering kniv til at skære hjernestammen aksialt og gøre det første snit på niveau med rostral midbrain gennem den overlegne colliculus at opnå to skiver til at afsløre substantia nigra. Skær hjernestammen i 10, otte millimeter skiver og pas på at inkludere nedskæringer, der passerer gennem rostralpons nær den overlegne margener af den fjerde ventrikel til at observere locus caeruleus og gennem medulla oblongata ringere end den akustiske stria, lige over ringere toppen af den fjerde hjertekammer at opnå skiver, herunder dorsale motorkerne af vagus.
Mærk alle skiver i en rostral caudal måde som BS for hjernestamme efterfulgt af arabertal. Efter den sidste hjernestamme skal du bruge betegnelsen SC for rygmarv efterfulgt af arabertal. Skær lillehjernen på sagittal flyet for at adskille de to cerebellar halvkugler på niveau med vermis og udføre sagittal sektion for at få fem skiver fra hver halvkugle.
Navngiv alle udsnit fra vermis som CBR eller CBL for henholdsvis højre og venstre lillehjerne, og brug arabertal til at identificere hver sektion. Dernæst adskille de to halvkugler af cerebrum gennem corpus callosum på sagittal flyet, før udskæring halvkugle som ental langs koronale flyet passerer mellem den optiske chiasm og mammillary organer gennem frontallappen tidsmæssige pol, forreste cingulate, forreste commissure, kernen af minored, og basal ganglier. Lav et andet snit omkring en centimeter posteriort passerer gennem mammillary organer og udsætter de basale ganglier, forreste thalamus sub thalamus, og amygdala.
Fortsæt udskæring at dissekere den forreste og bageste regioner indtil 15 til 21 centimeter skiver er opnået for hver halvkugle. Placer skiven er på en flad overflade, som de er opnået efter deres oprindelige position i den forreste bageste retning fra frontal til occipital pole, med den del kontinuerlig med de tidligere dias vender opad. Når alle skiverne er placeret, skal du vælge de hovedafsnit, der skal fastsættes for histopatologi, herunder de tidligere erhvervede sektioner og hippocampale, parietal og occipital sektioner, og mærke skiverne som L eller R efterfulgt af arabertal, herunder en etiket, der angiver, om skiven skal fastgøres eller fryses.
Når alt væv er blevet sectioned og mærket, få et billede for hver serie af sektioner før deres fiksering eller frysning. For at fryse prøverne placere reserverede alternative væv sektioner på en pre frosset aluminium bakke og dække sektioner med en sikringsanlæg aluminiumsplade for at holde dem flade. Derefter fryses skiverne i flydende nitrogen i tre minutter, før de frosne prøver anbringes i en plastikpose mærket med deres tilsvarende identifikationskoder og skivenumre til opbevaring i den relevante kryogene kasse ved 80 grader Celsius.
For at fastsætte prøverne placere de reserverede alternative væv sektioner i de enkelte stykker gaze og placere skiver i 10% fosfat buffered formalin opløsning i fem dage i en fire grader Celsius koldt rum. 24 ud af 27 høstede hjerner fik den komplette neuropatologiske karakterisering med en bestemt klinisk patologisk diagnose. Foreløbig kvantitative elektroencefalogramanalyse af en serie på 36 hjernedonorer indikerer, at den vigtigste alfarytmeprocent er signifikant lavere ved større neurokognitive lidelser end ved normale ældre mild neurokognitiv lidelse.
Her vises et eksempel på en asymmetrisk patologi med en højreside atrofi tydeligt makroskopisk med de alvorlige ventrikulære dilatationer observeret i højre koronale sektion sammenlignet med venstre. Et andet tilfælde viser en infarkt af højre halvkugle, mens en anden prøve viser en klar atrofi af højre mammillary krop. Makro sektioner kan farves for at identificere myelin tab eller fordelingen af immunoraktivitet inden for halvkugler.
Disse prøver er fra tvillinger, der havde en klinisk udbrud af Alzheimers sygdom i forskellige tidsrammer på grund af epigenetiske og miljømæssige faktorer. Ikke desto mindre, den mikroskopiske analyse afslørede en meget lignende neuropatologisk billede indikerer en høj Alzheimers sygdom patologi og amyloid angiopati. Hos disse to patienter svarede den samme kliniske diagnose af Alzheimers sygdom imidlertid ikke helt til de neuropatologiske træk, som afslørede en demensduo i flere ætiologier.
Faktisk præsenterede det første tilfælde Lewy organer i gyrus enkelt løgn og substantia nigra. Og det andet tilfælde viste Lewy organer forbundet med Lewy neurites i amygdala og i mindreårige kerne. Fotografi af skiverne er omhyggeligt for en nøjagtig identifikation af de anatomiske områder under den mikroskopiske analyse.
Fikseringen og frysningen af enkeltskiver er også vigtige for at bevare vævsmikrostrukturen Omics topografien af genaktivering og proteinfordeling og korrelere disse data med histopatologien. Cellekulturer fra vel karakteriseret væv, også en undersøgelse af sygdomspatogenese. Bær altid passende personlige værnemidler som et optjent hjernevæv anses for potentielt smitsomt, og fordi det er nødvendigt at bruge farlige værktøjer som skarpe instrumenter og flydende nitrogen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
