Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Abbiategrasso Brain Bank protokoll för att samla in, bearbetning och karaktärisera åldrande hjärnor
Chapters
Summary June 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll beskriver en metod för att spåra enskilda hjärnan-åldrande banor genom en hjärna donation program och korrekt karakterisering av hjärnor. Brain givare är involverade i en långsiktig longitudinell studie inklusive seriella flerdimensionella bedömningar. Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av hjärnans bearbetning och en korrekt diagnostisk metodik.
Transcript
Eftersom en neurokognitiv störning prevalens ökar kontinuerligt, vårt mål är att få, karakterisera och lagra kvalitet hjärnvävnad prover för att uppnå korrekt diagnos och belysa de neurodegenerativa mekanismerna. Med tanke på hjärnans assymetri, tillåter vår provtagningsmetodik alla metastudier som ska utföras på histologiskt väldefinierade vävnader från båda halvkloten och de många data kan samlas in och korreleras genom djupinlärning. Additiva effekter på hjärnskador genom flera patologier observeras ofta.
Den definitiva diagnosen kräver att kombinera kliniska syndrom med de neuropatologiska resultaten att upptäcka sjukdom patogenes, och eventuella terapier. Färska skärförfaranden samt makro avsnitt förvaltning är knepigt men är också viktigt att uppnå goda resultat. Ett tränat och sammansvetsat team är avgörande för att övervinna dessa svårigheter.
Vårt protokoll innehåller en serie steg som krävs däggdjur fingerfärdighet, därför visuell demonstration kan vara mer användbar än beskrivande texter för forskare som vill behärska dessa tekniker. Efter att ha bekräftat thanatography, använd en skarp skalpell för att göra en hårbotten snitt genom håret huden och subkutan vävnad på koronaplattan från spetsen av mastoid processen på ena sidan till den andra, passerar över vertex. Separera de två veck i hårbotten försiktigt från skallen och fortsätt snittet tills den gula super orbital fett blir synlig.
Reflektera hårbotten anteriorly och dra den andra delen av vävnad posteriort. Med hjälp av en skalpell och tuppar, skörda ett litet prov av temporalmuskeln på varje sida av skallen, placera ett exemplar i 4%formaldehyd och det andra provet vid fyra grader Celsius. Med hjälp av en elektrisk såg skära skallen i en V skära på frontalsidan och ta bort skullcap.
Efter att ha klippt hjärnhinnorna, skörda en bit dura för fixering och en annan för frysning. Sätt in en 20 gauge 3,5 tums nål fäst vid en 10 milliliter spruta genom corpus callosum för att nå den tredje ventrikeln och dra tillbaka kolven för att få cirka 10 milliliter cerebral spinal vätska. Bedöma utseende färg och grumlighet av vätska och mäta pH.
Dra försiktigt på båda frontalloberna för att lyfta hjärnan och skära både synnerverna infundibulum, de inre halspulsådern och den tredje, fjärde, femte och sjätte kranialnerver. Skär tentorium för att nå den bakre fossa och skär vertebrala artärerna och de lägre kranialnerverna. Sätt sedan in skalpell så djupt som möjligt genom foramen magnum att skära den mest caudal delen av medula och försiktigt ta bort hela hjärnan.
Använd skalpell för att visas till benet över Meckel grotta och samla den gasseriska ganglion från varje sida för fixering och frysning. Använd en kirurgisk klubba och mejsel för att bryta beniga sella turcica och ta bort hypofysen för fixering i 4%formaldehyd. Inspektera skallen och hela hjärnan från makroskopiska förändringar och vaskulära förändringar.
Använd ett måttband för att mäta hjärnans tvär- och främre kroppshållningsdiametrar och väga hjärnan på en skala. Hämta försiktigt cirkeln av Willis för makroskopisk bedömning för förekomst av anatomiska varianter, lesioner eller kärlstenos. Separera och inspektera storhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen innan vävnaderna vägs individuellt.
Ta bort en till två, två till fyra centimeter kvadrat bitar av leptomeninges från konvexitet och bevara proverna i komplett hög glukos DMEM kultur medium vid fyra grader Celsius. Skörd tallkottkörteln för fixering i 4%formaldehyd och ta bort lukt glödlampor och synnerver för fixering och frysning av en av varje par. Placera storhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen på is vid fyra grader Celsius.
När alla vävnader av intresse har skördats använda en super lim lim för att sätta tillbaka benet och använda en kirurgisk nål, och icke-resorberbara suturer att sy tillbaka hårbotten. För hjärnan bank dissektion använda en dissekera kniv för att skära hjärnstammen axiellt och göra det första snittet i nivå med rostrala mellanhjärnan genom den överlägsna colliculus att få två skivor för att exponera substantia nigra. Skär hjärnstammen i 10, åtta millimeter skivor var noga med att inkludera nedskärningar som passerar genom rostral pons nära de överlägsna marginalerna av den fjärde ventrikeln för att observera locus caeruleus och genom medulla oblongata sämre än den akustiska stria, strax ovanför sämre spetsen av den fjärde ventrikeln för att få skivor inklusive dorsala motor kärnan i vagus.
Märk alla skivor på ett rostralt caudalsätt som BS för hjärnstam följt av arabiska siffror. Efter den sista hjärnstammen avsnitt, använd beteckningen SC för ryggmärgen följt av arabiska siffror. Skär lillhjärnan på sagittal planet för att separera de två cerebellar halvklot på nivån av vermis och utföra sagittal snittning för att få fem skivor från varje halvklot.
Namnge alla skivor från vermis som CBR eller CBL för höger respektive vänster lillhjärna, och använd arabiska siffror för att identifiera varje avsnitt. Därefter separera de två halvkloten i storhjärnan genom corpus callosum på sagittal planet innan skivning halvklotet som singularly längs koronaplanet passerar mellan den optiska chiasm och mammillary organ genom frontalloben temporalpolen, främre cingulate, främre commissure, kärna av minored och basala ganglierna. Gör en andra snitt ungefär en centimeter posteriort passerar genom mammillary organ och utsätta basala ganglierna, främre thalamus sub thalamus, och amygdala.
Fortsätt skivning att dissekera de främre och bakre regionerna tills 15 till 21 centimeter skivor har erhållits för varje halvklot. Placera skivan är på en plan yta som de uppnås efter sin ursprungliga position i den främre bakre riktningen från framsidan till occipital polen, med den del kontinuerlig med föregående diabilder uppåt. När alla skivor har placerats väljer de huvudsektioner som ska fastställas för histopatologi inklusive de tidigare förvärvade sektionerna och sektionerna hippocampus, parietal och occipital, och märka skivorna som L eller R följt av arabiska siffror inklusive en etikett som anger om skivan ska fixeras eller frysas.
När alla vävnader har sektionerat och märkts, skaffa en bild för varje serie avsnitt innan de fixering eller frysning. För att frysa proverna placera de reserverade alternativa vävnadssektionerna på en pre fryst aluminiumbricka och täcka sektionerna med en förregling aluminiumplatta för att hålla dem platta. Frys sedan skivorna i flytande kväve i tre minuter innan de frysta proverna placeras i en plastpåse märkt med sina motsvarande identifieringskoder och skiva nummer för en lagring i lämplig kryogen låda vid 80 grader Celsius.
För att fixera proverna placera de reserverade alternativa vävnadssektionerna i enskilda bitar av gasväv och placera skivorna i 10%fosfatbuffrad formalinlösning i fem dagar i ett fyra grader Celsius kylrum. 24 av 27 hjärnor som skördats fick den fullständiga neuropatologiska karakteriseringen med en bestämd klinisk patologisk diagnos. Preliminära kvantitativa elektroencefalogram analys av en serie av 36 hjärnan givare anger att de viktigaste alfa rytm procent är betydligt lägre i större neurokognitiva störningar än i normala äldre mild neurokognitiva störning.
Här ett exempel på en asymmetrisk patologi visas med en höger sida atrofi uppenbar makroskopiskt med de allvarliga ventrikulära dilations observerats i den högra koronasektionen jämfört med vänster. Ett annat fall visar en infarct av den högra hjärnhalvan, medan ett annat exemplar visar en tydlig atrofi av rätt mammillary kroppen. Makro sektioner kan färgas för att identifiera myelin förlust eller fördelningen av immunoreactivity inom halvklot.
Dessa prover är från tvillingar som hade en klinisk debut av Alzheimers sjukdom i olika tidsramar på grund av epigenetiska och miljömässiga faktorer. Ändå visade mikroskopiska analysen en mycket liknande neuropatologiska bild som anger en hög Alzheimers sjukdom patologi och amyloid angiopati. I dessa två patienter dock samma kliniska diagnos av alzheimers sjukdom inte exakt motsvarar de neuropatologiska funktionerna, som visade en demens duo i flera etiologies.
I själva verket fram det första fallet Lewy organ i gyrus enda lögn och substantia nigra. Och det andra fallet visade Lewy organ som är associerade med Lewy neurites i amygdala och i minderåriga kärnan. Fotografi av skivorna är noggrant för en korrekt identifiering av de anatomiska områdena under den mikroskopiska analysen.
Fixering och frysning av singlar skivor är också viktigt för att bevara vävnaden mikrostruktur Omics topografin av genaktivering och protein distribution och korrelera dessa data med histopatologin. Cellkulturer från väl karakteriserade vävnader, också en undersökning av sjukdomspatogenes. Alltid bära tillräcklig personlig skyddsutrustning som en vested hjärnvävnad anses potentiellt smittsam och eftersom användningen av farliga verktyg såsom vassa instrument och flytande kväve krävs.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
