Genetics
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बैक्टीरियल विल्ट रोग के सरल आनुवंशिक विश्लेषण के लिए राल्स्टोनिया सोलनेसेरम के साथ टीका के बाद टमाटर रूट परिवर्तन
Summary March 11th, 2020
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यहां, हम बैक्टीरियल मुरझानी रोग के अध्ययन के लिए सीधा आनुवंशिक विश्लेषण करने के लिए राल्स्टोनिया सोलनसेरम के साथ टीका के बाद टमाटर जड़ परिवर्तन के लिए एक बहुमुखी विधि प्रस्तुत करते हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह वैज्ञानिकों को टमाटर में बैक्टीरियल मुरझाना रोग का सीधा आनुवंशिक विश्लेषण करने की अनुमति देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि जीन अभिव्यक्ति और बाद में परख के हेरफेर कम समय में और उपकरण और संयंत्र विकास अंतरिक्ष की छोटी आवश्यकताओं के साथ किया जा सकता है । यह विधि बहुत बहुमुखी है, और इसे रोगजनक टीका और अन्य शारीरिक परख दोनों करने के लिए अन्य फसल पौधों पर लागू किया जा सकता है।
विट्रो में रोपण के हेरफेर के दौरान बंध्यता को बनाए रखने के लिए, प्लेटों को प्रवाह हुड के बाहर होने पर बंद रखना महत्वपूर्ण है। यह एक आसान तकनीक है, लेकिन यह हेरफेर के लिए कई कदम की आवश्यकता है । इस विधि के दृश्य छोटी चाल है कि पांडुलिपि में समझाने के लिए मुश्किल है देखने में मदद मिलेगी, अंय शोधकर्ताओं की मदद करने के लिए अपनी प्रयोगशालाओं में विधि को लागू करने के लिए ।
इस प्रक्रिया को प्रदर्शित करने में मदद करना एक स्नातक छात्र अचेन झाओ होगा । टमाटर के बीजों को स्टरलाइज करने और धोने के बाद, उन्हें बिना सुक्रोज के आधी ताकत मुर्शिज और स्कूग माध्यम में स्थानांतरित करें। बीज को तीन दिन तक 25 से 28 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर अंधेरे में रखें।
नौ वर्ग सेंटीमीटर पेट्री व्यंजन के अंदर 8.5 वर्ग-सेंटीमीटर फिल्टर रखें जिसमें आधी ताकत मुर्शिज और स्कूग माध्यम होते हैं, और प्रत्येक प्लेट पर छह अंकुरित टमाटर के बीज रखें। माइक्रोपोर टेप के साथ प्लेट को सील करें, और अंकुरित बीजों को तीन से चार दिनों के लिए 25 से 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। संयंत्र परिवर्तन से पहले 28 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ठोस पौंड माध्यम में एग्रोबैक्टीरियम राइजोजीन्स MSU440 बढ़ें ।
बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, रेडिकल और टमाटर के रोपण के हाइपोकॉस्टाइल के नीचे काटें। एलबी माध्यम की सतह से ए राइजोजीन बायोमास को फसल करने के लिए प्लास्टिक टिप्स या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें, और बैक्टीरियल बायोमास में कट टमाटर के रोपण को ध्यान से डुबोएं। इसके बाद, टमाटर के रोपण को दो सेंटीमीटर-बाय-चार सेंटीमीटर अर्धवृत्ताकार फिल्टर पेपर के साथ कवर करें ताकि उच्च आर्द्रता बनाए रखी जा सके और अस्तित्व और नए रूट विकास को सुविधाजनक बनाया जा सके।
रोपण को एक ऐसे वातावरण में उच्च आर्द्रता में रखना महत्वपूर्ण है जो वाष्पीकरण की अनुमति देता है। ऐसा करने के लिए, रोपण को फिल्टर पेपर से कवर करें, और प्लेट को माइक्रोपोर टेप के साथ बंद करें। 25 से 28 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर एक विकास कक्ष में छह से सात दिनों के लिए बदल टमाटर रोपण स्टोर करें ।
फिर नए उभरते बालों वाली जड़ों को काटने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें, और रोपण को नई बालों वाली जड़ों का उत्पादन करने की अनुमति दें। एक बार जब नई बालों वाली जड़ों की दूसरी पीढ़ी दिखाई देती है, तो रोपण के शीर्ष पर फिल्टर पेपर को हटा दें, और प्लेट को माइक्रोपोर टेप के साथ फिर से सील करें। वीवो इमेजिंग में पौधे के लिए डीएसरेड फ्लोरेसेंस या किसी अन्य उपकरण की कल्पना करने के लिए, सकारात्मक रूपांतरित जड़ों को चिह्नित करें, जिसे लाल फ्लोरेसेंस द्वारा पहचाना जा सकता है।
नकारात्मक गैर-परिवर्तित जड़ों को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, जिसे लाल फ्लोरेसेंस की कमी से पहचाना जा सकता है। मुख्य जड़ के रूप में परिवर्तित जड़ के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए आधी ताकत मुर्शिज और स्कूग माध्यम वाली एक नई प्लेट में लाल फ्लोरेसेंस दिखाने वाले रोपण को स्थानांतरित करें। बाद के समय बिंदुओं में फ्लोरोसेंट जड़ों के उद्भव की जांच करने के लिए एक ही प्लेट में लाल फ्लोरेसेंस नहीं दिखाने वाले रोपण रखें।
रोपण को दो सेंटीमीटर-बाय-चार सेंटीमीटर सेमीसर्कल फिल्टर पेपर के साथ कवर करें, प्लेट को सील करें, और रोपण को इनक्यूबेट करें ताकि उन्हें नई बालों वाली जड़ों का विकास हो सके। टीका बर्तन तैयार करें जहां जड़ों की सतह को पहले टीका बर्तनों को पानी से भिगोकर, किसी भी अतिरिक्त पानी को डालने और फिर उन्हें प्लास्टिक रोपण ट्रे में रखकर बैक्टीरियल इनोकुलम के संपर्क में आ जाएगा। चिमटी का उपयोग करके, चयनित रोपण को परिवर्तित जड़ों के साथ टीका बर्तन में स्थानांतरित करें।
ट्रे को प्लास्टिक की चादर या पारदर्शी ढक्कन से ढकें, और उन्हें 65% आर्द्रता के साथ 25 से 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें। पांच-छह दिन बाद कवर निकाल दें। 28 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में पांच पौंड तरल माध्यम में राल्सस्टोनिया बढ़ो, २०० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ, स्थिर चरण तक ।
बैक्टीरियल संख्या निर्धारित करने के लिए 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें। 1 के एक OD600 के लिए पानी के साथ जीवाणु संस्कृति पतला । 16 से 20 टीका बर्तन रखें जिसमें टमाटर के पौधे एक टीका ट्रे में बदल जाते हैं।
फिर ट्रे में पतला बैक्टीरियल इनोकुलम के 300 मिलीलीटर डालें, और पौधों को 20 मिनट तक इनोकुलम में भिगोने की अनुमति दें। इसके बाद, मिट्टी की एक परत के साथ एक नई ट्रे तैयार करें। टीका बर्तन को नई ट्रे में ले जाएं, और ट्रे को 75% आर्द्रता, 26 और 28 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान, और 12 घंटे के प्रकाश और 12 घंटे के अंधेरे के साथ एक विकास कक्ष में रखें।
यहां, बैक्टीरिया की जड़ों को बदल दिया जाता है और बैक्टीरिया मुरझाने की बीमारी के अध्ययन के लिए सीधा आनुवंशिक विश्लेषण करने के लिए रालस्टोनिया के साथ टीका लगाया जाता है। रोग के लक्षणों के विकास टमाटर के पौधों में एक खाली वेक्टर के साथ बदल जड़ों के साथ ट्रैक किया जाता है और एक राय के साथ बदल उन टमाटर CESA6 लक्ष्यीकरण निर्माण । रोग सूचकांक डेटा शून्य से चार तक मनमाने पैमाने के अनुसार समय के साथ एक ही प्रायोगिक इकाई से एकत्र किए जाते हैं और एक गॉसियन वितरण का पालन नहीं करते हैं, जो पैरामेट्रिक डेटा के लिए मानक परीक्षणों के उपयोग का फैसला करते हैं।
एक मानक दृष्टिकोण के रूप में, एक यू मान-व्हिटनी, दो पूंछ, गैर-पैरामेट्रिक परीक्षण दोनों नियंत्रण और संक्रमण घटता की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस विश्लेषण के अनुसार, दोनों घटता के औसत के बीच अंतर गैर महत्वपूर्ण प्रतीत होता है । रोग प्रगति वक्र के तहत क्षेत्र की मात्रा बताना भी संभव है, जो रोग प्रगति के कई टिप्पणियों को एक ही मूल्य में मिलाने की अनुमति देता है।
रोग प्रगति वक्र के तहत क्षेत्र संक्रमण प्रक्रिया के अंत में टमाटर CESA6 RNAi पौधों की तुलना में नियंत्रण संयंत्रों के लिए एक उच्च मूल्य से पता चलता है, यह दर्शाता है कि टमाटर CESA6-खामोश पौधों नियंत्रण संयंत्रों की तुलना में रालस्टोनिया संक्रमण के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं । विश्वास अंतराल उच्च संभावना के साथ, मूल्यों की एक श्रृंखला है जिसमें दिए गए चर की जनसंख्या मूल्य पाया जाता है, मूल्यांकन का एक तरीका प्रदान करते हैं। जैसा कि यहां देखा गया है, नियंत्रण और संक्रमण घटता के लिए ९५% विश्वास अंतराल के क्षेत्र में प्रतिरोध की एक उच्च संभावना का अनुमान है जब CESA6 खामोश है ।
रोग सूचकांक मूल्यों को बाइनरी डेटा में बदल दिया जा सकता है, जो शून्य के अनुरूप दो से कम रोग सूचकांक और एक रोग सूचकांक के बराबर या दो से अधिक है। यह रालस्टोनिया टीका के बाद एक अस्तित्व वक्र के प्रतिनिधित्व की अनुमति देता है। गेहान-ब्रेस्लो-विलकॉक्सन सांख्यिकीय परीक्षण के अनुसार नियंत्रण और संक्रमित पौधों के बीच जीवित रहने की दर में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं हैं ।
CESA6 की अभिव्यक्ति तो टीका कदम से पहले दो बेतरतीब ढंग से चयनित परिवर्तित जड़ों में विश्लेषण किया जाता है, दिखा रहा है कि राल्सोनिया के लिए बढ़ाया प्रतिरोध CESA6 की कम अभिव्यक्ति के साथ संबंधित है । चयन के दो दौर के बाद, 35 से 40% की परिवर्तन दर प्राप्त की जा सकती है, और अतिरिक्त चयन दौर करके इस मूल्य को बढ़ाया जा सकता है। इस प्रक्रिया को करते समय, उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए फिल्टर पेपर के टुकड़े से ढके रोपण को रखना और गैस विनिमय सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोपोर के साथ प्लेटों को सील करना महत्वपूर्ण है।
रूट ट्रांसफॉर्मेशन के बाद, रूट फिजियोलॉजी के अवलोकन या आणविक जीव विज्ञान, सेल जीव विज्ञान या बायोकेमिस्ट्री का उपयोग करके पौधे की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए कई उपचार लागू किए जा सकते हैं। मुख्य रूप से, यह तकनीक सीमित संसाधनों वाले शोधकर्ताओं को टमाटर की जड़ों में बैक्टीरियल संक्रमण का आनुवंशिक विश्लेषण करने की अनुमति देगी।
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