Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tomato Root Transformatie gevolgd door inenting met Ralstonia Solanacearum voor eenvoudige genetische analyse van bacteriële wilt ziekte
Summary March 11th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een veelzijdige methode voor tomatenworteltransformatie, gevolgd door inenting met Ralstonia solanacearum om eenvoudige genetische analyse uit te voeren voor de studie van bacteriële verwelkingsziekte.
Transcript
Dit protocol is belangrijk omdat het wetenschappers in staat stelt om eenvoudige genetische analyse van bacteriële verwelking ziekte in tomaat uit te voeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de manipulatie van genexpressie en daaropvolgende testen in korte tijd en met de kleine eisen van apparatuur en plantengroeiruimte kan worden uitgevoerd. Deze methode is zeer veelzijdig, en het kan worden toegepast op andere gewasplanten om zowel pathogenenenting als andere fysiologische tests uit te voeren.
Om de steriliteit te behouden tijdens manipulatie van zaailingen in vitro, is het belangrijk om de platen gesloten te houden wanneer ze zich buiten de stroomkap bevinden. Dit is een eenvoudige techniek, maar het vereist meerdere stap voor manipulatie. De visualisatie van deze methode zal helpen om kleine trucs die moeilijk uit te leggen zijn in het manuscript te zien, andere onderzoekers helpen om de methode in hun laboratoria te implementeren.
Helpen om deze procedure aan te tonen zal Achen Zhao, een afgestudeerde student. Na het steriliseren en wassen van de tomatenzaden, breng ze naar half-sterkte Murashige en Skoog medium zonder sacharose. Houd de zaden in het donker op een temperatuur tussen 25 en 28 graden Celsius gedurende drie dagen.
Plaats autoclaved 8,5 vierkante centimeter filters in negen vierkante centimeter petrischaaltjes met halve sterkte Murashige en Skoog medium, en plaats zes ontkiemde tomatenzaden op elk bord. Verzegel de plaat met Micropore tape en ontcued de ontkiemde zaden op 25 tot 28 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen. Kweek de Agrobacterium rhizogenes MSU440 in vaste LB medium met de juiste antibiotica voor twee dagen op 28 graden Celsius voor de transformatie van de plant.
Met behulp van een steriele scalpel, snijd de radicle en de onderkant van de hypocotyl van de tomatenzaailingen. Gebruik plastic tips of een scalpelblad om biomassa van A.rhizogenes te oogsten van het oppervlak van het LB-medium en dompel de gesneden tomatenzaailingen voorzichtig onder in de bacteriële biomassa. Bedek hierna de tomatenzaailingen met een halfomvormig filterpapier van twee centimeter bij vier centimeter om een hoge luchtvochtigheid te behouden en overleving en nieuwe wortelontwikkeling te vergemakkelijken.
Het is belangrijk om de zaailingen in een hoge luchtvochtigheid te houden in een omgeving die transpiratie mogelijk maakt. Om dit te doen, bedek de zaailingen met filterpapier, en sluit de plaat met Micropore tape. Bewaar de getransformeerde tomatenzaailingen zes tot zeven dagen in een groeikamer bij een temperatuur tussen de 25 en 28 graden Celsius.
Gebruik dan een steriele scalpel om de nieuwe opkomende harige wortels te knippen en laat de zaailingen nieuwe harige wortels produceren. Zodra de tweede generatie van nieuwe harige wortels verschijnt, verwijder het filterpapier op de top van de zaailingen, en verzegel de plaat met Micropore tape opnieuw. Om DsRed fluorescentie of andere apparatuur voor plant in vivo beeldvorming te visualiseren, markeer de positieve getransformeerde wortels, die kunnen worden geïdentificeerd door de rode fluorescentie.
Gebruik een scalpel om de negatieve niet-getransformeerde wortels te verwijderen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun gebrek aan rode fluorescentie. Breng de zaailingen die rode fluorescentie vertonen over naar een nieuwe plaat met halfsterkte Murashige en Skoog medium om de ontwikkeling van de getransformeerde wortel als hoofdwortel te vergemakkelijken. Houd de zaailingen die geen rode fluorescentie vertonen in dezelfde plaat om de opkomst van fluorescerende wortels in latere tijdstippen te controleren.
Bedek de zaailingen met een twee centimeter-bij-vier centimeter halve cirkel filter papier, verzegel de plaat, en broeden de zaailingen om ze te laten ontwikkelen nieuwe harige wortels. Bereid de inentingpotten waar het oppervlak van de wortels zal worden blootgesteld aan de bacteriële entmateriaal door eerst weken de inenting potten met water, gieten uit overtollig water, en vervolgens het plaatsen van hen in een plastic plantbak. Breng met behulp van een pincet de geselecteerde zaailingen met getransformeerde wortels over naar de inentingspotten.
Bedek de lade met plastic folie of een transparant deksel, en houd ze op 25 tot 28 graden Celsius met 65% vochtigheid. Verwijder het deksel na vijf of zes dagen. Kweek Ralstonia in vijf LB vloeibaar medium in een orbitale shaker bij 28 graden Celsius, met schudden bij 200 rpm, tot de stationaire fase.
Meet de optische dichtheid op 600 nanometer om de bacteriële getallen te bepalen. Verdun de bacteriële cultuur met water tot een OD600 van 1. Plaats 16 tot 20 inentingspotten die omgevormde tomatenplanten bevatten in een inentingslade.
Giet vervolgens 300 milliliter verdund bacterieel en in de lade en laat de planten 20 minuten in het entmateriaal weken. Bereid hierna een nieuwe lade met een laag potgrond. Verplaats de ingeënte potten in de nieuwe lade en plaats de trays in een groeikamer met een luchtvochtigheid van 75%, een temperatuur tussen 26 en 28 graden Celsius en een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur duisternis.
Hier worden tomatenwortels getransformeerd en ingeënt met Ralstonia om eenvoudige genetische analyse uit te voeren voor de studie van bacteriële verwelkingsziekte. De ontwikkeling van ziektesymptomen wordt bijgehouden in tomatenplanten met wortels getransformeerd met een lege vector en die getransformeerd met een RAI constructie gericht op tomaat CESA6. De ziekte-index gegevens worden verzameld uit dezelfde experimentele eenheid in de tijd volgens een willekeurige schaal van nul tot vier en niet volgen een Gaussische distributie, het uitsluiten van het gebruik van standaardtests voor parametrische gegevens.
Als standaardbenadering wordt een U Mann-Whitney, tweestaartige, niet-parametrische test gebruikt om zowel de controle- als infectiecurven te vergelijken. Volgens deze analyse lijkt het verschil tussen de medianen van beide krommen niet significant te zijn. Het is ook mogelijk om het gebied onder de progressiecurve van de ziekte te kwantificeren, waardoor meerdere waarnemingen van de vooruitgang van de ziekte kunnen worden gecombineerd tot één waarde.
Het gebied onder de ziekte voortgangscurve toont een hogere waarde voor controleplanten in vergelijking met tomaat CESA6 RNAi planten aan het einde van het infectieproces, wat aangeeft dat tomaat CESA6-zwijgende planten zijn beter bestand tegen Ralstonia infectie dan controleplanten. Betrouwbaarheidsintervallen bieden een manier om, met grote waarschijnlijkheid, een reeks waarden te schatten waarin de bevolkingswaarde van een bepaalde variabele wordt gevonden. Zoals hier te zien, het gebied van de 95%betrouwbaarheid interval voor de controle en infectie curven schatten een hogere kans op weerstand wanneer CESA6 wordt gedempt.
Ziekte-indexwaarden kunnen worden omgezet in binaire gegevens, rekening houdend met een ziekte-index lager dan twee die overeenkomt met nul en een ziekte-index gelijk aan of hoger dan twee die overeenkomen met een. Dit maakt de vertegenwoordiging van een overlevingscurve na Ralstonia inenting mogelijk. De verschillen in de overlevingskans tussen de controle en de besmette planten zijn niet statistisch significant volgens de Gehan-Breslow-Wilcoxon statistische test.
De expressie van CESA6 wordt vervolgens geanalyseerd in twee willekeurig geselecteerde getransformeerde wortels voor de inentingsstap, waaruit blijkt dat de verbeterde weerstand tegen Ralstonia correleert met de verminderde expressie van CESA6. Na twee selectierondes kan een transformatiepercentage van 35 tot 40% worden verkregen en deze waarde kan worden verhoogd door extra selectierondes uit te voeren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de zaailingen bedekt te houden met een stuk filterpapier om een hoge luchtvochtigheid te behouden en om de platen te verzegelen met Micropore om gasuitwisseling te garanderen.
Na de worteltransformatie kunnen veel van de behandelingen worden toegepast om de plantrespons te bestuderen door observatie van wortelfysiologie of het gebruik van moleculaire biologie, celbiologie of biochemie. Voornamelijk zal deze techniek onderzoekers met beperkte middelen in staat stellen om genetische analyse van bacteriële infectie in tomatenwortels uit te voeren.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE