Genetics
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番茄根转化后与拉子托尼亚索拉纳卡鲁姆接种，直接遗传分析细菌性威尔特病
Summary March 11th, 2020
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在这里，我们提出了一种用于番茄根转化的通用方法，然后用Ralstonia索兰卡鲁姆接种，对细菌枯萎病的研究进行直接的基因分析。
Transcript
该协议意义重大，因为它允许科学家对番茄中的细菌枯萎病进行直接的基因分析。该技术的主要优点是，可以在短时间内进行基因表达和随后的测定，并满足设备和植物生长空间的较小要求。这是非常多用的方法，可以应用于其他作物进行病原体接种和其他生理检测。
为了在体外操作幼苗时保持无菌性，当板在流罩外时保持板材关闭非常重要。这是一个简单的技术，但它需要多个步骤进行操作。此方法的可视化将有助于查看手稿中难以解释的小技巧，帮助其他研究人员在实验室中实现该方法。
帮助证明这个程序将是赵阿晨，一个研究生。消毒和清洗番茄种子后，将它们转移到半强度的Murashige和Skoog介质，没有蔗糖。将种子保持在黑暗中，温度在25至28摄氏度之间三天。
将 8.5 平方厘米的过滤器放在含有半强度 Murashige 和 Skoog 介质的 9 平方厘米培养皿内，并在每个盘子上放置六个发芽番茄种子。用微孔胶带密封板，在25至28摄氏度下孵育发芽的种子3至4天。在植物转化前28摄氏度下，用适当的抗生素在固体LB介质中种植农业杆菌MSU440。在28摄氏度下种植。
使用无菌手术刀，切下番茄幼苗的底片和底。使用塑料尖端或手术刀刀片从 LB 介质表面收获 A.rhizogenes 生物量，并小心地将切开的番茄幼苗浸入细菌生物量。在此之后，用两厘米四厘米的半圆形滤纸覆盖番茄幼苗，以保持高湿度，促进生存和新的根部发育。
重要的是保持幼苗在高湿度的环境中，允许蒸腾。为此，用滤纸盖住幼苗，用微孔胶带盖住盘子。在25至28摄氏度的温度下，将经过改造的番茄幼苗存放在生长室中6至7天。
然后用无菌的手术刀切割新的毛根，让幼苗产生新的毛根。第二代新毛根出现后，取出幼苗顶部的滤纸，再用微孔胶带封住盘子。要可视化 DsRed 荧光或任何其他用于植物体内成像的设备，请标记正转化根，该根部可以通过红色荧光识别。
使用手术刀去除负非转化根，这可以通过它们缺乏红色荧光来识别。将显示红色荧光的幼苗转移到含有半强度 Murashige 和 Skoog 介质的新板中，以促进以转化根为主要根的根的发展。将不显示红色荧光的幼苗放在同一个盘子中，以检查荧光根在后期时间点的出现。
用两厘米四厘米的半圆形滤纸盖住幼苗，封上盘子，孵育幼苗，让幼苗发育出新的毛根。准备接种盆，其中根的表面将暴露在细菌接种，首先浸泡在接种盆用水，倒出任何多余的水，然后把它们放在一个塑料种植托盘。使用钳子，将具有转化根的选定幼苗转移到接种盆中。
用塑料包装或透明盖子盖住托盘，在 65% 湿度下将其保持在 25 至 28 摄氏度。五、六天后取下盖子。在28摄氏度的轨道摇床中生长5LB液体介质，在200转/小时时摇晃，直到静止相。
测量 600 纳米的光学密度以确定细菌数量。用水稀释细菌培养，使其为OD600的1。将含有转化番茄植物的16至20个接种罐放入接种盘中。
然后将300毫升稀释的细菌菌分倒入托盘中，让植物在浸入进水浸20分钟。在此之后，准备一个新的托盘与一层盆栽土壤。将接种的锅放入新托盘中，将托盘放入湿度为 75%的生长室，温度在 26 至 28 摄氏度之间，以及 12 小时光和 12 小时黑暗光的光度。
在这里，番茄根被改造和接种与拉尔斯顿尼亚进行直接的基因分析，为研究细菌枯萎病。疾病症状的发展在番茄植物中被跟踪，其根部用空载体转化，用RAA结构针对番茄CESA6进行转化。疾病指数数据根据从零到四的任意比例从同一实验单元收集，不遵循高斯分布，排除了对参数化数据使用标准测试。
作为标准方法，使用 U Mann-Whitney 双尾非参数测试来比较控制和感染曲线。根据此分析，两条曲线的中位数之间的差值似乎不显著。也可以量化疾病进展曲线下的区域，从而可以将疾病进展的多个观测结果合并为一个值。
与感染过程结束时的番茄CESA6 RNAi植物相比，疾病进展曲线下的区域显示，与番茄CESA6 RNAi植物相比，控制植物的抗药性更高，表明番茄CESA6沉默的植物比控制植物对拉尔斯顿病感染的耐药性更高。置信区间提供了一种以高概率估计一系列值的方法，其中找到了给定变量的总体值。如此处，控制和感染曲线的 95% 置信区间区域估计当 CESA6 静音时，抗药性的可能性更高。
疾病指数值可以转换为二进制数据，因为疾病指数低于 2，对应于零，疾病指数等于或高于 1。这允许在拉尔斯顿接种后表示生存曲线。根据Gehan-Breslow-Wilcoxon的统计测试，对照植物与受感染植物的存活率差异在统计学上并不显著。
然后，在接种步骤之前，将CESA6的表达分析成两个随机选择的转化根，表明对Ralstonia的增强耐药性与CESA6的减少表达相关。经过两轮选择后，可获得 35 到 40% 的转换率，并且可以通过执行其他选择回合来增加此值。执行此程序时，重要的是保持幼苗用一块滤纸覆盖以保持高湿度，并用 Micropore 密封板以确保气体交换。
根转化后，许多治疗方法可以通过观察根生理学或使用分子生物学、细胞生物学或生物化学来研究植物反应。主要，这项技术将允许资源有限的研究人员对番茄根部细菌感染进行基因分析。
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