Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia Solanacearum for enkel genetisk analyse av bakteriell wiltsykdom
Summary March 11th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en allsidig metode for tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia solanacearum for å utføre enkel genetisk analyse for studiet av bakteriell wilt sykdom.
Transcript
Denne protokollen er betydelig fordi det tillater forskere å utføre enkel genetisk analyse av bakteriell wilt sykdom i tomat. Den største fordelen med denne teknikken er at manipulering av genuttrykk og påfølgende analyser kan utføres på kort tid og med de små kravene til utstyr og plantevekstplass. Dette er metoden er svært allsidig, og den kan brukes på andre avlingsplanter for å utføre både patogen inokulasjon og andre fysiologiske analyser.
For å opprettholde steriliteten under manipulering av frøplanter in vitro, er det viktig å holde platene lukket når de er utenfor strømningshetten. Dette er en enkel teknikk, men det krever flere trinn for manipulasjon. Visualiseringen av denne metoden vil bidra til å se små triks som er vanskelige å forklare i manuskriptet, og hjelper andre forskere til å implementere metoden i sine laboratorier.
Å bidra til å demonstrere denne prosedyren vil være Achen Zhao, en utdannet student. Etter sterilisering og vasking av tomatfrøene, overfør dem til halvfast Murashige og Skoog medium uten sukrose. Hold frøene i mørket ved en temperatur mellom 25 og 28 grader Celsius i tre dager.
Plasser autoklaverte 8,5 kvadratcentimeter filtre inne i ni kvadratcentimeter Petri-retter som inneholder halvfast Murashige og Skoog medium, og legg seks spirede tomatfrø på hver tallerken. Forsegle platen med Micropore tape, og inkuber de spirede frøene ved 25 til 28 grader Celsius i tre til fire dager. Vokse Agrobacterium rhizogenes MSU440 i solid LB medium med passende antibiotika i to dager ved 28 grader Celsius før anlegget transformasjon.
Bruk en steril skalpell, kutt radikkelen og bunnen av hypocotyl av tomatplanter. Bruk plastspisser eller et skalpellblad for å høste biomassen A.rhizogenes fra overflaten av LB-mediet, og dypp forsiktig de kuttede tomatplantene i bakteriebiomassen. Etter dette dekker du tomatplantene med et to centimeter-med-fire centimeter halvsirkelformet filterpapir for å holde høy luftfuktighet og lette overlevelse og ny rotutvikling.
Det er viktig å holde plantene i høy luftfuktighet i et miljø som tillater transpirasjon. For å gjøre dette, dekk plantene med filterpapir, og lukk platen med Micropore tape. Oppbevar de forvandlede tomatplantene i seks til syv dager i et vekstkammer ved en temperatur mellom 25 og 28 grader Celsius.
Bruk deretter en steril skalpell for å kutte de nye nye hårete røttene, og la plantene produsere nye hårete røtter. Når den andre generasjonen av nye hårete røtter vises, fjern filterpapiret på toppen av plantene, og forsegle platen med Micropore tape igjen. For å visualisere DsRed fluorescens eller annet utstyr for anlegg in vivo imaging, markere de positive forvandlede røttene, som kan identifiseres ved den røde fluorescens.
Bruk en skalpell for å fjerne de negative ikke-forvandlede røttene, som kan identifiseres ved deres mangel på rød fluorescens. Overfør plantene som viser rød fluorescens til en ny plate som inneholder halvfast Murashige og Skoog medium for å lette utviklingen av den forvandlede roten som hovedroten. Hold plantene som ikke viser rød fluorescens i samme plate for å sjekke fremveksten av fluorescerende røtter i senere tidspunkter.
Dekk plantene med et to centimeter-av-fire centimeter halvsirkelfilterpapir, forsegle platen og inkuber plantene for å la dem utvikle nye hårete røtter. Forbered inokulasjonspottene hvor overflaten av røttene vil bli utsatt for bakteriell inokulering ved først å slikke inokulasjonspottene med vann, helle av overflødig vann og deretter plassere dem i et plastplantingsbrett. Ved hjelp av pinsett, overfør de valgte plantene med forvandlede røtter til inokulasjonspottene.
Dekk brettet med plastfolie eller et gjennomsiktig lokk, og hold dem på 25 til 28 grader Celsius med 65% fuktighet. Fjern dekselet etter fem eller seks dager. Grow Ralstonia i fem LB flytende medium i en orbital shaker på 28 grader Celsius, med risting på 200 rpm, til den stasjonære fasen.
Mål den optiske tettheten ved 600 nanometer for å bestemme bakterietallene. Fortynn bakteriekulturen med vann til en OD600 av 1. Plasser 16 til 20 inokulasjonspotter som inneholder forvandlede tomatplanter til et inokulasjonsbrett.
Hell deretter 300 milliliter fortynnet bakteriell inokus i skuffen, og la plantene suge i inokulumet i 20 minutter. Etter dette, forberede en ny skuff med et lag av potting jord. Flytt de vaksinerte pottene inn i det nye brettet, og legg brettene i et vekstkammer med 75% fuktighet, en temperatur mellom 26 og 28 grader Celsius, og en fotoperiode på 12 timer med lys og 12 timer med mørke.
Her blir tomatrøtter forvandlet og inokulert med Ralstonia for å utføre enkel genetisk analyse for studiet av bakteriell wilt sykdom. Utviklingen av sykdomssymptomer spores i tomatplanter med røtter forvandlet med en tom vektor og de som er forvandlet med en RAI-konstruksjon rettet mot tomat CESA6. Sykdomsindeksdataene samles inn fra samme eksperimentelle enhet over tid i henhold til en vilkårlig skala fra null til fire og følger ikke en gaussisk fordeling, og utelukker bruk av standardtester for parametriske data.
Som en standard tilnærming brukes en U Mann-Whitney, to-tailed, ikke-parametrisk test for å sammenligne både kontroll- og infeksjonskurvene. Ifølge denne analysen ser forskjellen mellom medianene i begge kurvene ut til å være ikke signifikant. Det er også mulig å kvantifisere området under sykdomsprogresjonskurven, noe som gjør det mulig å kombinere flere observasjoner av sykdomsfremgang til en enkelt verdi.
Området under sykdomsprogresjonskurven viser en høyere verdi for kontrollplanter sammenlignet med tomat CESA6 RNAi-planter på slutten av infeksjonsprosessen, noe som indikerer at tomat CESA6-stilnede planter er mer motstandsdyktige mot Ralstonia-infeksjon enn kontrollanlegg. Konfidensintervaller gir en måte å estimere, med høy sannsynlighet, et verdiområde der befolkningsverdien til en gitt variabel er funnet. Som sett her, området av 95% konfidensintervall for kontroll og infeksjon kurver anslå en høyere sjanse for motstand når CESA6 er dempet.
Sykdomsindeksverdier kan forvandles til binære data, med tanke på en sykdomsindeks lavere enn to som tilsvarer null og en sykdomsindeks lik eller høyere enn to tilsvarende en. Dette gjør det mulig å fremse en overlevelseskurve etter Ralstonia inokulasjon. Forskjellene i overlevelsesraten mellom kontrollen og de infiserte plantene er ikke statistisk signifikante i henhold til gehan-Breslow-Wilcoxon statistisk test.
Uttrykket for CESA6 analyseres deretter i to tilfeldig utvalgte transformerte røtter før inokulasjonstrinnet, noe som viser at den forbedrede motstanden mot Ralstonia korrelerer med det reduserte uttrykket for CESA6. Etter to runder med valg kan en transformasjonshastighet på 35 til 40 %oppnås, og denne verdien kan økes ved å utføre flere valgrunder. Mens du utfører denne prosedyren, er det viktig å holde plantene dekket med et stykke filterpapir for å opprettholde høy luftfuktighet og forsegle platene med Micropore for å sikre gassutveksling.
Etter rottransformasjonen kan mange av behandlingene brukes til å studere planteresponsen ved observasjon av rotfysiologi eller ved hjelp av molekylærbiologi, cellebiologi eller biokjemi. Hovedsakelig vil denne teknikken tillate forskere med begrensede ressurser til å utføre genetisk analyse av bakteriell infeksjon i tomatrøtter.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
