Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
عدوي المكورات الرئوية من خلايا بطانة الإنسان الاساسيه في التدفق المستمر
Chapters
Summary October 31st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
تصف هذه الدراسة الرصد المجهري للالتزام بالمكورات الرئوية لسلاسل عامل فون ويلبراند المنتجة علي سطح الخلايا البطانية الاساسيه البشرية المتمايزة تحت ضغط القص في ظروف التدفق المحددة. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل التصور التفصيلي للهياكل الخلوية المحددة والقياس الكمي للبكتيريا عن طريق تطبيق إجراءات المناعة التفاضلية.
Transcript
استخدام هذا النظام ثقافة الخلية البطانية تمكن من استيعاب الوضع في تدفق الدم. ومع هذا الوضع، يمكننا تحليل عمليات العدوى البكتيرية بما في ذلك تحديد النواقل البكتيرية وكذلك ناقلات الخلايا التي تشارك في هذه العملية. تمهد هذه التقنية الطريق لاستكشاف تأثير العدوى البكتيرية على سلامة الأوعية الدموية ، بما في ذلك أيضًا التأثير على آليات تكوين المورفين ، على استجابات الالتهاب والتنظيم المناعي.
هذه التقنية تتطلب بعض التعامل خاصة من الخلايا البطانية، وبالتالي وصف البصرية هو أفضل من مجرد تفسير لفظي. توفر هذه الطريقة رؤى في العديد من المجالات الأخرى للبحث المرتبطة مع أنظمة الأوعية الدموية المشبعة مثل تمايز الخلايا البطانية، والتئام الجروح، ونشأة الورم والتسيس الوعائي. واحدة من الخطوات الرئيسية هي زراعة الخلايا الموحدة وكذلك التعامل الدقيق مع الخلايا البطانية الأولية.
هذه التقنية تتطلب بعض معالجة ثقافة الخلية الخاصة التي لا يمكن أن تكون واضحة من خلال التفسير اللفظي فقط. للبدء، العمل في بيئة معقمة باستخدام مقاعد البدلاء نظيفة. استخدام ماصة لحقن 100 ميكرولترات من 2٪ معقم معقم بورسين الجيلاتين برنامج تلفزيوني في خزان واحد من شريحة قناة درجة الحرارة.
ضع شريحة القناة المغلفة بالجيلاتين على لوحة البوليسترين الرقيق أو الستايروفوم لمنع انخفاض في درجة حرارة الشريحة باستخدام حقنة لوير ملليلتر واحدة لإضافة 100 ميكرولترات من أربع مرات 10 إلى تعليق HUVEC الخامس لكل ملليلتر في الشريحة للبذور وزراعة HUVEC. احتضان شريحة القناة مع HUVEC لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، ملء كل خزان متوسط في كلا طرفي الشريحة القناة مع 60 ميكرولترات من المتوسط ECGMS.
احتضان لمدة ساعة أخرى في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. المقبل، لضبط مضخة microfluidic، أولاً ربط ضخ توازني تعيين وحدة مضخة، وملء مع 13.6 ملليلتر من المتوسط ECGMS وبدء برنامج التحكم في المضخة. في قائمة إعداد الوحدة المائعة، حدد مجموعة الضخ المناسبة ونوع شريحة الغرفة باستخدام النوافذ لأسفل التمرير.
اختر 0.007 dyne الثانية لكل سنتيمتر مربع في البرنامج لللزوجة المتوسطة. خارج الحاضنة، قم بتوصيل زجاجة مليئة بخرز السيليكا التجفيف إلى أنابيب ضغط الهواء. حدد معلمات التدفق في قائمة البرامج، تعيين الضغط إلى 40 ملليبار وشطف أنابيب المضخة مع المتوسطة السائلة عن طريق بدء التدفق المتوسط المستمر.
نحن نضمن وجود مرفق خلية ضيقة باستخدام HUVECs المزروعة بشكل غير تفرعي بالإضافة إلى التركيز على الحصول على فقاعات الهواء من النظام وكذلك استخدام إمدادات الطاقة المستقلة لنظام المضخة. اضغط على وصلات أنابيب لإزالة فقاعات الهواء وضمان عدم وجود فقاعات الهواء يتم تعميمها في نظام المضخة. لتوصيل شريحة القناة، وقف تدفق الدورة الدموية في برنامج التحكم في المضخة وعقد تدفق المتوسطة وأنابيب الضخ عن طريق لقط الأنابيب بالقرب من اتصال Luer.
ربط شريحة القناة وبالتالي تجنب فقاعات الهواء. في التبويب متقدمة التحكم في مضخة البرمجيات، واستخدام أداة البرمجيات دورة الخالق لبرنامج دورات الإجهاد القص المطلوب لزراعة تدفق. برمج مستويات التوتر القص لتداول التدفق والبدء في التخبط على المدى الطويل.
تبدأ مع خمسة dyne لكل سنتيمتر مربع الذي يتوافق مع معدل تدفق 5.44 ملليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة تليها تدفق مستمر في الإجهاد القص من 10 dyne لكل سنتيمتر مربع الذي يتوافق مع معدل تدفق 10.85 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. التحكم في ضخ الخزانات المتوازنة. ضع الوحدة المائعة مع شريحة القناة المتصلة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ابدأ التحكم في برنامج المجهر وضبط إعدادات المبدأ للمراقبة المجهرية الفلورية عن طريق تحديد إعدادات التصفية المناسبة. للتصور المجهري، ضع الوحدة السائلة في غرفة التدفئة 37 درجة مئوية. ضع شريحة القناة على خشبة المجهر المُجهَّز مسبقًا.
السيطرة على مورفولوجيا الخلية وسلامة طبقة HUVEC قبل حقن الهستامين والبكتيريا إلى الدورة الدموية تدفق. الحفاظ على إعداد التدفق. الحث على إطلاق VWF من أجسام Palade القابلة للحياة من الغدد الثنية عن طريق حقن 136 ميكرولتردات من محلول مخزون الهستامين 100 ملليمولار من خلال منفذ حقن في وسيط ECGMS المتداولة في أنابيب النزف.
للكشف المناعي من سلاسل VWF متعددة، حقن 20 ميكروغرام من VWF محدد فيتك مترافق في حجم 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في تعميم 13.6 ملليلتر من المتوسط ECGMS. لتحديد كمية المرفق المكورات الرئوية إلى سلاسل VWF التي تم إنشاؤها على أسطح خلايا HUVEC ، حقن 1.35 مرة 10 إلى CFU الثامنة لكل ملليلتر RFP التعبير عن Pneumococci في الحد الأقصى لحجم ملليلتر واحد في وسط ECGMS باستخدام منفذ الحقن. حدد هدف غمر الزيت 63X لتكبير المجهر وضبط إعدادات مرشح الفلوريسنس في برنامج المجهر إلى قناة RFP مع فلتر كشف 540 نانومتر للكشف عن RFP التعبير عن Pneumococci.
لتحديد كمي من المرفقات البكتيرية لسلاسل VWF، إنشاء لقطات من مداخن Z من ما لا يقل عن 30 وجهات النظر الميدانية التمثيلية كل يحتوي على حوالي 10 HUVEC سليمة شكلياً، وعدد كمية Pneumococci. لتقييم المرفق البكتيري بعد التثبيت قبل تلطيخ الفلوروست المناعي ، ووقف التدفق ، وإزالة 10 ملليلتر من المتوسط ECGMS من خزانات المضخة ، وإضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تكملها بنسبة 5 ٪ شبهفورمالدهيد والمضي قدما وفقا للمخطوطة. في هذا البروتوكول، تبدأ الخطوات التجريبية المبدأ مع ما قبل زراعة الخلايا البطانية الأولية إلى subconfluency في قارورة ثقافة الخلية.
ثم يتم زرع الخلايا في شريحة قناة مغلفة بالجيلاتين. وتزرع البكتيريا على لوحات أجار تليها زراعة في وسيطة معقدة السائل إلى منتصف مرحلة السجل. بالنسبة لثقافة الخلايا الدقيقة، يتم توصيل شريحة قناة مع الخلايا البطانية إلى أنابيب الضخ من وحدة سائلة في نظام المضخة وتخضع لتدفق مستمر لتمايز الخلايا.
تم إنتاج سلاسل VWF عن طريق حقن الهستامين في إجهاد القص من 10 dyne ثانية لكل سنتيمتر مربع ومراقبتها مجهرياً بواسطة الكشف المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة تحمل علامة VWF. بعد حقن بروتين الفلوريسين الأحمر التعبير عن البكتيريا إلى المتوسطة المتداولة، وكان المرفق المكورات الرئوية إلى سلاسل VWF تصور مجهري في الوقت الحقيقي من قبل انبعاثات الفلوريسنس في 450 نانومتر. بعد تثبيت الخلايا باستخدام PFA ، يوفر تلطّخ الفلور المناعية التفاضلي تصور المرفق البكتيري في نقاط زمنية محددة للعدوى.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو ضمان وجود مرفق خلية ضيقة على سطح الشريحة عن طريق ضبط مستويات الإجهاد القص الفسيولوجية وتجنب تقلبات ضغط المضخة الشديدة. بالإضافة إلى التصور المجهري ، يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة الآثار الدوائية لمضادات العدوى الجديدة وكذلك لتحليل العواقب طويلة الأجل لعمليات العدوى الوعائية. هذا النظام مضخة يضخ مسببات الأمراض البكتيرية بضغط الهواء لمنع أي انتقال عن طريق الهباء الجوي.
من المستحسن اتباع احتياطات السلامة البيولوجية.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
