Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl
Summary October 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit manuscript presenteert protocollen voor het chirurgisch toebrengen van gecontroleerde bot en scherpe ruggenmergletsels aan een regeneratieve Axolotl (Ambystoma mexicanum).
Transcript
Dit protocol is de eerste om een gestandaardiseerde kneuzing type letsel in axolotl ruggenmerg regeneratie onderzoek te introduceren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het trauma in de dagelijkse kliniek nabootst, waardoor de kans groter wordt dat een toekomstige bevinding kan worden vertaald. De kneuzing letsel apparaat kan worden gebruikt in een ander klein dier model van dwarslaesie.
De chirurgische techniek is moeilijk, vooral de laminectomie. Daarom is het raadzaam om de procedure op een groot aantal dieren ex vivo te trainen voordat u overgaat tot een in vivo operatie. Om te beginnen, het opzetten van een chirurgische tafel door het plaatsen van een standaard Petri schotel onder een stereo microscoop, op de top van een chirurgische textiel doek.
Plaats de verdoofde axolotl in de gevoelige positie op de petrischaal en wikkel het in papieren handdoeken, zodat de staart wordt blootgesteld. Identificeer de achterste ledematen en gebruik een micro schaar om de eerste incisie net caudal aan hen te maken. Maak de verticale incisie van de kiel tot de benige bekendheid van de spineuze processen worden gevoeld.
Breid de snede zijdelings uit, zodat de incisie de gehele breedte van de staart doorkruist en de spineuze processen met tangen grijpt om de juiste diepte te garanderen. Vervolgens strek de verticale incisie een millimeter onder het spinous proces aan beide zijden. Plaats het dier aan de ene kant, en vanaf het ventrale punt van de verticale incisie, maak een horizontale incisie van ongeveer 15 millimeter voor dieren die 10 tot 20 gram in gewicht.
Gebruik de schaar om onmiddellijk te ontleden door de horizontale incisie totdat de wervelkolom wordt gevoeld in de middellijn. Zet het dier vervolgens aan de andere kant en herhaal het proces. Na het ontleden in de diepe mediale vlak van beide zijden, ontleden door de middellijn om de twee horizontale insnijdingen te verbinden.
Beweeg vervolgens het vrije stuk staart en kiel naar één kant om de spineuze processen bloot te leggen. Plaats het dier in de gevoelige positie met het hoofd naar de niet-weelderige kant van de chirurg, en gebruik een paar tangen om de spineuze processen te grijpen, net caudal aan de achterste ledematen. Breng een zachte lift omhoog en naar het hoofd van het dier.
Plaats de messen van een micro schaar horizontaal rond het proces en snijd het voorzichtig door, waardoor het ruggenmerg wordt blootleggen. Pak het spineuze proces caudal aan de ene net verwijderd, en herhaal het proces. Het is absoluut noodzakelijk dat u een constante lift op het spinous proces houdt om ervoor te zorgen dat het geen schade aan het ruggenmerg toebrengt wanneer verwijderd.
Als het blootgestelde gebied niet breed genoeg is, gebruik dan twee paar tangen om de laminae aan beide zijden van het ruggenmerg te grijpen en ze zijdelings te draaien met een zachte beweging. Bij het verwijderen van het spineuze proces kan het nodig zijn om dit in meerdere stappen te doen. Daarom kan het blootstellen van het ruggenmerg enkele minuten duren.
Om een kneuzing type letsel te introduceren, gebruik maken van een petrischaaltje om het dier over te dragen aan de trauma-eenheid en schijnen een zaklamp op het ruggenmerg. Plaats vervolgens de kneuzingstrauma-eenheidscilinder boven het blootgestelde ruggenmerg met behulp van de microregelaars en laat de cilinder zakken totdat deze vlak is met de laminae. Bevestig de vallende staaf aan de elektromagneet en plaats de gewenste vallende hoogteverstellingscilinder op de trauma-eenheid.
Plaats vervolgens de vallende staaf op de cilinder, schakel de elektromagneet uit om de staaf op het blootgestelde ruggenmerg te laten vallen en gebruik de schroef van de hoogteverstelling om de staaf weer omhoog te tillen. Als de invoering van een scherpe blessure, snijd het ruggenmerg in een perfecte verticale snede, herhaal dan de bezuinigingen twee millimeter aan de staartzijde van het lichaam. Voel de messen van de schaar schrapen langs het ventrale deel van het ruggenmergkanaal om ervoor te zorgen dat de sneden compleet zijn, en til het stuk ruggenmerg uit het kanaal.
Om de chirurgische wond te sluiten, plaatst u 10 punt O nylon hechtingen van het meest caudale deel van de horizontale incisie die de wonden in één laag sluit en werkt naar het verticale deel van de incisie. Wanneer een hoek wordt bereikt, draai de petrischaal en hecht de andere horizontale incisie, dan stel hechtingen op de verticale incisies. Gebruik voorafgaand aan het beëindigen van anesthesie een hoge frequentie echografie om beelden van de verwonding te verwerven.
Lijn de punt van de transducer af op de lengteas van het dier en dompel het onder in de benzocaine-oplossing totdat het slechts een paar millimeter boven de kiel achter de achterste ledematen van het dier is. Identificeer de plaats van de verwonding en verwerf beelden volgens de manuscriptrichtingen. Als je klaar bent, breng je de axolotl terug naar de verdovingsvrije oplossing door de petrischaal onder te dompelen in vijf centimeter diep zoet water en het dier eraf te laten glijden.
De dwarslaesie die met behulp van dit protocol werd veroorzaakt, werden gevalideerd met behulp van hematoxylin en eosine-vlekken op gewonde en schijnoxolotls. Om regeneratie te bevestigen, werden histologische secties negen weken na de blessure voorbereid. De beelden toonden een herstelde dwarslaesieverbinding in de gewonde dieren.
Letsel en regeneratie we zijn ook gevolgd door het onderzoeken van neurologische functie. De reactie van het dier op stimulatie van de staart werd gescoord met hogere scores die wijzen op hogere tactiele en nociceptieve zintuiglijke functies. Onder de gewonde dieren, was er een verlies van neurologische functie drie weken na letsel, en een geleidelijke restauratie binnen negen weken.
De dwarslaesie werd ook gevisualiseerd met behulp van ultrasone grafische beeldvorming, die het mogelijk maakte voor visualisatie van de rugslagader als een marker van de integriteit van het vat. Hi-field MRI-scans werden onmiddellijk uitgevoerd na de blessure en op drie, zes en negen weken. Deze scans waren in staat om oedeem en herstel van de integriteit van het ruggenmerg te visualiseren.
De scans onmiddellijk na letsel, waren gevoelig voor lawaai. Patiënt en zorgvuldige chirurgie zal de weg vrijmaken voor een succesvol resultaat na laminectomie zonder vroegtijdige schade aan het ruggenmerg. Na deze procedure kunnen verschillende in vivo methoden worden toegepast, zoals beeldvorming en elektrofysiologische technieken.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
