Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
البقاء علي قيد الحياة خليه purkinje في الثقافات شريحة المخيخ الوراثية
Chapters
Summary December 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
الثقافات شريحة التنميط العضوي هي أداه قويه لدراسة العمليات العصبية أو التنكسية/التجدد. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي نماذج وفاه النمو العصبي للخلايا Purkinje في الثقافات شريحة الفئران المخيخ. هذا الأسلوب قد تستفيد البحوث في اكتشاف المخدرات نيوروبروتكتيف.
Transcript
تعتبر ثقافة شريحة Organotypic أداة قوية لدراسة العمليات العصبية النمائية والتنكسية أو التجديدية. ويمكن استخدام هذه التقنية لفرز بسرعة الجزيئات المرشحة لإمكاناتها العصبية. هذه الطريقة تحاكي عن كثب في ظروف الجسم الحي ، مقارنة بثقافات الخلايا الأولية المنفصلة ، حيث يتم الحفاظ على بنية مجموعة الأنسجة واتصالات الخلايا الخلوية الأصلية داخل مستويات الأقسام.
هنا نبرهن على دراسة موت خلايا بوركينجي في المخيخ النامي. ولكن ثقافة شريحة الأعضاء هي مناسبة على قدم المساواة لنموذج الأمراض العصبية في كل منطقة الجهاز العصبي المركزي تقريبا. إثبات الإجراء مع جنيفر Rakotomamonjy سيكون شون ماكديرموت، وهو فني من مختبري.
قبل حصاد شرائح cerebellar، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية معقمة، ملء كل بئر من لوحة ثقافة ستة بئر مع ملليلتر واحد من فراغ تصفية الثقافة المتوسطة، وإضافة عامل الدوائية ذات الفائدة لآبار العلاج، وحجم متساو من السيارة إلى آبار التحكم. باستخدام ملقط معقمة، وضع واحد 0.4 ميكرومتر المسام حجم PTFE غشاء مرشح إدراج في كل بئر، مع الحرص على تجنب فقاعات في واجهة كل غشاء والمتوسطة، وتكليل المتوسطة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ساعتين. لحصاد المخيخ، استخدم ملقط خلع الملابس مباشرة لفهم رأس الجرو من الأنف، واستخدام مقص العين مباشرة لقطع فتح فروة الرأس من النهاية الخلفية في الجانب الآخر إلى خط الوسط.
قطع فتح الجمجمة بنفس الطريقة، مشيرا إلى نصائح مقص إلى الخارج لتجنب إتلاف المخيخ، واستخدام ملعقة لنقل الدماغ إلى طبق 60 ملليمتر تحتوي على HBSS الباردة وخمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الجلوكوز. استخدام ملقط خلع الملابس على التوالي لتشريح بعناية خارج المخيخ، واستخدام ملقط ناعم منحني معقمة لوضع الأنسجة على قرص بلاستيكي على طاولة القطع من المروحية الأنسجة. تدوير الجدول القطع لتوجيه الأنسجة للسماح لاقتناء المقاطع parasagittal، وسحب مقبض الطاولة الإفراج إلى اليمين لنقل الجدول القطع حتى يتم وضع شفرة على حافة الأنسجة.
ثم ضبط سمك شريحة إلى 350 ميكرومتر، وسرعة شفرة إلى متوسطة، وبدء المروحية. عندما يتم تقطيع المخيخ بأكمله، قم بإيقاف تشغيل المروحية. باستخدام ملقط معقمة، عقد القرص على طبق جديد 60 ملليمتر.
استخدام ماصة نقل لطرد HBSS بالإضافة إلى الجلوكوز على القرص بحيث تقع شرائح في الطبق. ثم، لمس العينات بأقل قدر ممكن، استخدم microprobe لفصل الشرائح. استخدام ماصة نقل لتحديد أجزاء من المخيخ على مقربة من vermis على إدراج ثقافة الخلية الفردية في لوحة ستة جيدا، واستخدام microprobe لوضع شرائح في مركز كل إدراج.
عندما تم وضع جميع الشرائح، وpireate بعناية أي HBSS الزائدة بالإضافة إلى الجلوكوز، والعودة لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. لطخة الفلوروس المناعية، وإزالة افرنح من كل بئر، وغسل إدراج مع برنامج تلفزيوني. إصلاح شرائح مع ملليلتر واحد من 4٪ paraformaldehyde الباردة في بئر كل إدراج، و 500 ميكرولترات على رأس كل إدراج لمدة ساعة واحدة.
في نهاية التثبيت، وغسل إدراج أربع مرات لمدة 10 دقائق مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد تحت كل إدراج و 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد على رأس كل إدراج لكل غسل على شاكر المدارية. قبل ملء كل بئر من لوحة 24-well مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني TB، واستخدام فرشاة الطلاء لنقل شرائح cerebellar من كل ثقافة الخلية إدراج في الآبار الفردية من لوحة 24 جيدا. Permeabilize وحجب شرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة، وتسمية الخلايا مع 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة المخففة في برنامج تلفزيوني - السل في البئر بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر المدارية. في صباح اليوم التالي، وغسل شرائح أربع مرات لمدة 10 دقائق و 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل على شاكر، قبل وضع علامة على العينات مع الأجسام المضادة الثانوية الفلوروومي المناسبة مترافق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، و counterstain أقسام مع 500 microliters من وصمة عار النووية المناسبة في بئر لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
واستخدم ماصة نقل لتركيب الشرائح على الشرائح الزجاجية. ثم اسمحوا الهواء أقسام جافة تماما قبل إعادة الجفاف مع برنامج تلفزيوني وتركيب الأنسجة مع أغطية مغلفة مع ما يقرب من 80 ميكرولترات من المتوسط المتصاعدة. بمجرد أن يتم شفاء المتوسطة المتصاعدة ، تصبح أقسام cerebellar جاهزة للصور.
في اليوم التالي للولادة ستة، بقاء خلية بوركيني منخفض في عينات التحكم، بما يتفق مع نافذة الضعف المعروفة. يزداد البقاء على قيد الحياة مع تقدم الحيوان المانح في السن وخروجه من هذه الفترة الحرجة. علاج شرائح cerebellar مع تركيز عال من كلوريد البوتاسيوم النتائج في الحث الناجح من إزالة القطب والبقاء على قيد الحياة.
للحصول على نتائج متناسقة وقابلة لإعادة إنتاجها، من الضروري تحديد أقسام سيريبيلار صحية، وإجراء إعداد الثقافة بأكبر قدر ممكن من الكفاءة. تتجاوز تطبيقات ما بعد الاستزراع الفلورات المناعية. كما يمكن استخدام شرائح organotypic لدراسات التعبير عن بروتين الجينوم، ورصد نشاط الدوائر العصبية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية والكالسيوم التصوير الحي.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
