Neuroscience
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Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures
Chapters
Summary December 18th, 2019
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Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.
Transcript
La cultura delle fette organotipiche è un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo e degenerativi o rigenerativi. Questa tecnica può essere utilizzata per schermare rapidamente le molecole candidate per il loro potenziale neuroprotettivo. Questo metodo imita da vicino le condizioni in vivo, rispetto alle colture cellulari primarie dissociate, poiché l'architettura del set tissutale e le connessioni cellule-cellule native sono conservate all'interno dei piani delle sezioni.
Qui dimostriamo lo studio della morte cellulare di Purkinje nel cervelletto in via di sviluppo. Ma la cultura delle fette organotipiche è ugualmente adatta per modellare le malattie neurodegenerative in quasi tutte le regioni del sistema nervoso centrale. A dimostrare la procedura con Jennifer Rakotomamonjy sarà Sean McDermott, un tecnico del mio laboratorio.
Prima di raccogliere le fette cerebellari, in un armadio di biosicurezza sterilizzato, riempire ogni pozzo di una piastra di coltura a sei pozzetti con un millilitro di mezzo di coltura filtrato sottovuoto e aggiungere l'agente farmacologico di interesse ai pozzi di trattamento e un volume uguale di veicolo ai pozzi di controllo. Utilizzando forcep sterili, posizionare un inserto del filtro a membrana PTFE di dimensioni dei pori di 0,4 micrometri in ogni pozzo, facendo attenzione a evitare bolle all'interfaccia di ogni membrana e mezzo, ed equilibrare il mezzo in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% per due ore. Per raccogliere il cervelletto, utilizzare le alessamenti di medicazione dritta per afferrare la testa del cucciolo per il naso e utilizzare forbici per gli occhi dritti per aprire il cuoio capelluto dall'estremità posteriore lateralmente alla linea mediana.
Tagliare il cranio allo stesso modo, puntando le punte della forbice verso l'esterno per evitare di danneggiare il cervelletto, e utilizzare una spatola per trasferire il cervello su un piatto da 60 millimetri contenente HBSS freddo e cinque milligrammi per millilitro di glucosio. Utilizzare le forcelle di medicazione dritta per sezionare attentamente il cervelletto e utilizzare forcette fini curve sterili per posizionare il tessuto su un disco di plastica sul tavolo di taglio di un elicottero tissutale. Ruotare la tabella di taglio per orientare il tessuto per consentire l'acquisizione di sezioni parasagittali e tirare la manopola di rilascio del tavolo a destra per spostare il tavolo di taglio fino a quando la lama non è posizionata sul bordo del tessuto.
Quindi regolare lo spessore della fetta a 350 micrometri e la velocità della lama su medio e avviare l'elicottero. Quando l'intero cervelletto è stato tagliato, spegnere l'elicottero. Utilizzando forcep sterili, tenere il disco su un nuovo piatto da 60 millimetri.
Utilizzare una pipetta di trasferimento per lavare HBSS più glucosio sul disco in modo che le fette cadano nel piatto. Quindi, toccando i campioni il più minimamente possibile, utilizzare una microsoperta per separare le fette. Utilizzare la pipetta di trasferimento per selezionare sezioni del cervelletto vicino ai vermi su singoli inserti di coltura cellulare nella piastra a sei pozzi e utilizzare la microsoperta per posizionare le fette al centro di ogni inserto.
Una volta posizionate tutte le fette, aspirare attentamente l'HBSS in eccesso più il glucosio e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Per la colorazione dell'immunofluorescenza, rimuovere il supernatante da ogni pozzo e lavare gli inserti con PBS. Fissare le fette con un millilitro di paraformaldeide fredda al 4% nel pozzo di ogni inserto e 500 microlitri sopra ogni inserto per un'ora.
Al termine della fissazione, lavare gli inserti quattro volte per 10 minuti con un millilitro di PBS fresco sotto ogni inserto e 500 microlitri di PBS fresco sopra ogni inserto per lavaggio su uno shaker orbitale. Precompilare ogni pozza di una piastra da 24 porri con 500 microlitri di PBS-TB e utilizzare un pennello per trasferire le fette cerebellari da ogni inserto di coltura cellulare in singoli pozzi di una piastra da 24 porri. Permeabilizzare e bloccare le fette a temperatura ambiente per un'ora.
Alla fine dell'incubazione, etichettare le cellule con 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito in PBS-TB per pozzo durante la notte a quattro gradi Celsius sullo shaker orbitale. La mattina successiva, lavare le fette quattro volte per 10 minuti e 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio sullo shaker, prima di etichettare i campioni con gli anticorpi secondari coniugati al fluoroforo appropriati per due ore a temperatura ambiente sullo shaker, protetti dalla luce. Al termine dell'incubazione, controsostenere le sezioni con 500 microlitri di una macchia nucleare appropriata per pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce.
E utilizzare una pipetta di trasferimento per montare le fette su vetrini. Quindi lasciare asciugare completamente le sezioni prima di reidratare con PBS e montare i tessuti con coverlips rivestiti con circa 80 microlitri di mezzo di montaggio. Una volta che il mezzo di montaggio si è polimeritato, le sezioni cerebellari sono pronte per essere immagini.
Al sesto giorno postnatale, la sopravvivenza delle cellule di Purkinje è bassa nei campioni di controllo, coerentemente con la loro nota finestra di vulnerabilità. La sopravvivenza aumenta man mano che l'animale donatore invecchia e esce da questo periodo critico. Il trattamento delle fette cerebellari con un'alta concentrazione di cloruro di potassio si traduce in un'induzione riuscita della loro depolarizzazione e sopravvivenza.
Per ottenere risultati coerenti e riproducibili, è fondamentale selezionare sezioni cerebellari sane e eseguire la configurazione delle impostazioni cultura nel modo più efficiente possibile. Le applicazioni post-coltura vanno oltre l'immunofluorescenza. Poiché le fette organotipiche possono essere utilizzate per studi di espressione delle proteine del genoma e per monitorare l'attività del circuito neuronale usando l'elettrofisiologia e l'imaging dal vivo di calcio.
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