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Induzir epilepsia pós-traumática em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática difusa repetitiva
Chapters
Summary February 10th, 2020
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Este protocolo sistemático descreve um novo modelo animal de epilepsia pós-traumática após lesão cerebral traumática repetitiva. A primeira parte detalha etapas para indução traumática de lesão cerebral usando um modelo modificado de queda de peso. A segunda parte fornece instruções sobre a abordagem cirúrgica para sistemas de aquisição de dados eletroencefalográficos de um único e multicanal.
Transcript
Nosso protocolo é o primeiro a detalhar um modelo de camundongo de epilepsia pós-traumática induzida por lesão cerebral traumática leve. O uso de um modelo de lesão cerebral traumática leve e difusa imita um aspecto importante da patologia da lesão cerebral traumática humana que quase sempre tem um componente difundido. Para desenvolver biomarcadores e tratamentos, são necessárias pesquisas utilizando modelos que reproduzem adequadamente aspectos da patologia humana.
Nosso modelo de lesão cerebral traumática também tem o potencial de fornecer uma visão dos mecanismos que causam comprometimento da função cerebral após lesão cerebral traumática leve ou concussão. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo da dor, coloque o mouse em uma almofada de espuma e posicione a cabeça do mouse sob o tubo de queda de peso. Coloque um disco de aço inoxidável de 1,3 milímetros de diâmetro plano de 880 miligramas de espessura no centro da cabeça do animal entre os olhos e as orelhas.
Remova o pino no tubo de queda de peso para liberar a haste de peso de 100 gramas de uma altura de 50 centímetros. Para induzir uma lesão falsa nos camundongos de controle, remova a haste de peso do tubo para evitar a liberação acidental do pino durante a queda de peso. Após a indução da queda de peso, coloque o animal de costas em uma almofada de aquecimento coberta com uma toalha absorvente poli forrada estéril com monitoramento até a recumbência total.
Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola limpa que foi aquecida em uma almofada de aquecimento com gel de recuperação e algumas peças de chow umedecidos por 45 minutos. Para preparar o campo cirúrgico para implantação de eletrodos EEG, coloque um sensor de temperatura sobre a almofada e coloque o rato re-anestesiado do cérebro em uma cortina estéril em cima da almofada de aquecimento no aparelho estereotático. Depois de fixar a cabeça no lugar com barras de ouvido, aplique pomada lubrificante nos olhos do animal e use creme depilatório para remover o cabelo do couro cabeludo.
Desinfete a pele exposta com três cotonetes alternados de 20 segundos de solução antisséptica cirúrgica de iodo povidone e 70% etanol em movimento circular. Após a remoção do couro cabeludo, aplique pequenas hemostatas nas bordas abertas da pele para expandir a área exposta. Em seguida, use o bisturi para remover suavemente o periósteo e cotonete do crânio com peróxido de hidrogênio.
Quando o crânio é limpo de tecido e exibe uma aparência esbranquiçada, seque o osso com uma gaze ou cotonete estéril. Para implantação de eletrodos, use uma broca de alta velocidade com uma broca de aço redonda de 0,5 milímetros a 5.000 a 6.000 rotações por minuto para criar seis orifícios de rebarba para os eletrodos do parafuso. Quando todos os furos tiverem sido perfurados, coloque os seis eletrodos de parafuso nos orifícios de rebarba e misture meia colher de pó de cimento dental com várias gotas de solvente.
Use uma espátula para mexer até que a mistura de cimento dental seja brega, mas maleável e dura o suficiente para ser devidamente condensada quando colocada no crânio do animal. Aplique o cimento sobre toda a superfície exposta do crânio e cada eletrodo de parafuso. Após um a dois minutos, ligue o ferro de solda e coloque a montagem da cabeça de três EEG em um braço estereotático.
Posicione a montagem da cabeça sobre o crânio para que as seis posições de chumbo do fio combinem com a posição do cabo de cada eletrodo de parafuso. Abaixe o dispositivo para que sua parte ventral repouse sobre o cimento dentário. Torça o fio de cada chumbo de cada um dos eletrodos do parafuso com o fio correspondente do suporte da cabeça, solde cada par de fio torcido para condução adequada do sinal e use uma tesoura para aparar qualquer excesso de fio.
Dobre cada par de fios soldados ao redor da montagem da cabeça. Quando todos os pares tiverem sido dobrados, cubra todo o fio com cimento dentário fresco deixando apenas a porção preta do suporte da cabeça exposta. Libere os hemostatos segurando os retalhos da pele e aplique antisséptico de clorexidina na área ao redor do implante para evitar infecções.
Em seguida, transfira o animal do aparelho para um equilíbrio para medir o peso do animal como referência para monitoramento futuro antes de colocar o animal em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento quente com monitoramento, gel de recuperação e algumas peças umedecidos de chow. Nesta figura, uma convulsão espontânea em um rato 97 dias após a repetida queda de peso traumatismo craniano registrado usando uma montagem de cabeça de três EEG configurada como demonstrado neste protocolo de vídeo é mostrada. Aqui, uma convulsão eletrográfica espontânea não convulsiva registrada em um rato 65 dias após a repetida queda de peso de lesão cerebral traumática é mostrada.
Nesta figura, uma convulsão espontânea em um rato 23 dias após repetida queda de peso lesão cerebral traumática foi registrada usando um suporte de cabeça EEG. O poder espectral de uma convulsão típica indica a maior densidade de 10 a 40 hertz com um pico de 15 hertz. Este protocolo demonstra os cronogramas para o início da convulsão em animais após a queda de peso repetitivo de lesão cerebral traumática demonstrando a incidência de agrupamento convulsivo em alguns animais e enfatizando a importância de adquirir registros contínuos e não intermitentes.
A colocação adequada do disco de aço, a implantação cuidadosa dos eletrodos do parafuso e a solda cuidadosa dos cabos são cruciais para um experimento de longo prazo bem sucedido. Após o monitoramento do EEG, animais com lesões cerebrais que desenvolvem convulsões podem ser estratificados daqueles que não fazem para análise posterior de suas diferenças celulares, moleculares e fisiológicas. Estratificar animais com epilepsia pós-traumática daqueles que incorrem em lesões cerebrais traumáticas, mas não desenvolvem convulsões, é fundamental para o desenvolvimento de intervenções e biomarcadores.
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