Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Microinjectrode system för kombinerad drog infusion och elektrofysiologi
Chapters
Summary November 13th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar ett microinjectrode-system som är utformat för elektrofysiologi och assisterad leverans av experimentella sonder (dvs. nanosensorer, mikroelektroder), med valfri drog infusion. Allmänt tillgängliga mikroflödessystem komponenter är kopplade till en kanyl som innehåller sonden. Ett steg-för-steg-protokoll för microinjectrode konstruktion ingår, med resultat under muscimol infusion i makak cortex.
Transcript
Detta microinjectrode system är utformat för läkemedelsinfusion, elektrofysiologi, och leverans och hämtning av experimentella sonder som mikroelektroder och nanosensorer. Det är optimerat för upprepad användning i vaken beter djur med mindre penetrationsskador på omgivande vävnader. Microinjectrode-systemet kan konfigureras för flera ändamål.
Den första är ett enkelt arrangemang av kanylen för placering av en experimentell sond som annars skulle vara för ömtålig för att tränga in i dura mater. Den andra är en mikrofluidisk infusion av ett läkemedel antingen självständigt eller kopplas till en kanyl som innehåller en experimentell sond. De mikrofluidiska komponenterna i systemet möjliggör leverans av volymer i nanoliterskalan.
Mät längden på kanylen och nanosensorsonden eller mikroelektroden. Probe måste vara längre än kanylen med den längd som är att sticka ut från kanylspets plus ungefär en centimeter. Under en förstoringsglas, ladda sonden i kanylen genom ryggen för att skydda sondens spets.
Sätt in kanylen som innehåller sonden i T-korsningen från botten ferrule. Placera kanylens övre flat-end sida mitt i T-korsningen. Undvik att blockera korsningen via kanylen genom att dra tillbaka den tillbaka i korsningen och dra sedan åt den.
Fäst en slang på toppen av mikroelektroden. Tillbaka ladda mikroelektoden genom kapillärslangen, T-korsningen, kanylen, och motsvarande ferrules. Skär mikroelektoden i önskad längd och skrapa av änden.
Se till att den bakre änden av elektroden sticker ut mindre än en centimeter från kapillärslangens baksida och spetsen på elektroden sticker ut från kanylen på önskat avstånd på undersidan. Placera mikroelektrodterminalen i guldstiftet och löda guldstiftet till mikroelektrodterminalen. Tillsätt epoxilim mellan guldstiftet och den övre ferrule för att fästa mikroelektoden på ferrule.
Efter att epoxin är härdad, helst i mer än 24 timmar, skruva loss den övre ferrule för att se till att mikroelektoden helt dras in inuti kanylen. För att konstruera den mikrofluidiska kretsen, placera en bred bräda på en stabil yta. Placera de två trevägsventilerna parallellt med de längsta sidorna av den breda brädan cirka 12 centimeters mellanrum med en port vänd mot varandra.
Använd skruvar för att fixera ventilerna till den breda styrelsen och skär ytterligare 10 centimeter kapillärrör för linjalen linjen och placera den i mellan. Använd standard ferrules för att dra åt slangen till ventilernas vända portar. Skär 10 till 20 centimeter av kapillärslangen och använd standard ferrules och Luer-låskontakterna för att koppla slangen på sprutan till en av portarna på ingångsventilen.
Skär en liten bit kapillär och anslut den till utmatningsventilen som spolningsledning. Skär två längre bitar av kapillärrör runt 100 centimeter för att ansluta utmatningsventilen till microinjectrode. Anslut läkemedelspumpen och märkpennapumpen till ingångsventilen.
Se först till att den experimentella sonden för mikroelektrod dras in i kanylen. För att fästa en skräddarsydd adapter till microinjectroden med hjälp av skruvar, topplasta microinjectrode genom styrröret och säkra den till den skräddarsydda mikro-drivadaptern med hjälp av ett par skruvar. Mät djupet av mikro drivläge vid vilken microinjectrode sticker ut från styrröret, sedan dra tillbaka den en centimeter för att förbereda för insättning.
För mikroinfusionsexperiment, anslut hjärnlinjen till den oanvända T-korsningsöppningen av microinjectroden. Använd en vanlig ferrule och dra åt med ferrule-skiftnyckeln. Se till att den övre ferrule är åtdragna också.
Placera sedan mikrodriften över en bägare. Ladda klorhexidin på 20 gram per liter i en milliliter gas snäva sprutan och placera den i läkemedelspumpen. Vrid flödesriktningen på ventilerna och ställ in en låg flödeshastighet på 50 till 200 mikroliter per minut så att vätskan går från läkemedelspumpen genom ingångsventilen till utgående ventilen och ut hjärnlinjen.
Spola kretsen med klorhexidin i minst 10 minuter. Upprepa spolningen med steril saltlösning och sedan med luft. Applicera försiktigt luddfria våtservetter vid korsningarna för att avslöja eventuella vätskeläckage genom ferrules.
Det mest kritiska steget är att kontrollera att monteringen av injicerod och mikrofluidisk krets är läckagefri. Ladda läkemedlet i 500 microliter gas tight spruta, komprimera luften och sedan placera den i läkemedelspumpen. Justera flödet till 50 mikroliter per minut och låt vätskan färdas tills några droppar är kvar i mikroinjectroden.
Sedan, blötlägg styrröret i klorhexidin vid koncentrationen av 20 gram per liter i 15 minuter. Vrid riktningen på utmatningsventilen mot spolledningen för att tränga undan markören då markörpumpen är avancerad tills en klar färgkant och olja observeras på linjallinjen. Se till att det alltid finns olja mellan läkemedlet och färgen för att inte blanda de två vattenlösliga material och förlora den skarpa kanten mellan dem.
Markera utgångsläget för denna oljefärgningslinje. Efter den nödvändiga experimentella uppställningen drar du tillbaka mikroelektroden i kanylen genom att lossa den övre ferrule. Fäst mikrodrivningen på inspelningskammaren och sänk styrröret för att tränga in i dura.
Därefter sänks mikroinjectroden till cirka två millimeter ovanför inspelningsplatsen som ligger i hjärnan. Dra åt topp ferrule och anslut guldstiften till inspelningssystemet. Fortsätt att avancera microinjectrode till målplatsen.
Sedan, växla ut ventilen till hjärnlinjen. För infusionsexperiment, använd den manuella microsyringe pumpen för att flytta kolonnen av olja med 0,5 centimeter varje minut. När önskad volym har infunderats, växla utgående ventilen mot spolledningen.
I denna studie, injektion av en GABA En agonist genom den högra hjärnhalvan FEF området utfördes för reversibel inaktivering av frontalt öga fältet medan djuret avslutade en minne-guidad saccade uppgift. Polar plot visar prestanda excentricitet för olika platser i förhållande till fixeringspunkten. Prestanda minskade tydligt i den vänstra visuella hemifield två timmar efter injektion.
Saccade spår för åtta perifera minnesplatser före och efter Muscimol injektion i FEF visas här. Saccade noggrannhet i den vänstra visuella hemifield minskade efter Muscimol injektion. När inställningen är klar är metoden mycket tillförlitlig och robust.
På grund av utfällningen av små molekyler inom röret och portarna krävs dock en grundlig spolning före varje användning och efter varje experiment för att hålla den mikrofluidiska fri från hinder och läckor. Även om metoden visades i frontalögonfältet i en icke-mänsklig primat, kan principen tillämpas på någon annan hjärnregion där någon kombination av elektrisk stimulering, inspelning och läkemedelsinjektion önskas i arter av gnagare storlek eller större. Vårt system har flexibiliteten att användas för inspelning antingen självständigt eller i kombination med läkemedelsinjektion och har förmågan att exakt placera någon ömtålig experimentell sond skyddad från skador genom dura mater och neural vävnad med minimal vävnadsskada på grund av dess lilla kanyldiameter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
