Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform
Chapters
Summary October 6th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol indeholder instruktioner til implementering af multiphoton litografi til at fabrikere tredimensionelle arrays af fluorescerende fiducial markører indlejret i poly (ethylenglycol)-baserede silicagelrogeler til brug som reference-fri, trækkraft mikroskopi Platforme. Ved hjælp af disse instruktioner forenkles måling af 3D-materiale stamme og beregning af cellulære distraktionerne for at fremme målinger af trækkraft med høj gennemløb.
Transcript
Trækkraftmikroskopi bruges til at måle cellegenererede kræfter. Denne protokol forenkler indsamlingsanalysen af trækkraftdata for at gøre dem mere tilgængelige for uerfarne brugere. Den største fordel ved denne teknik i forhold til eksisterende reference-fri trækkraft mikroskopi platforme, er, at multiphoton litografi giver en hurtig og nem mønster indstilling redesign i henhold til de enkelte eksperimentelle behov.
Der er mange vigtige trin i fremstillingen og gennemførelsen af denne nye reference-fri trækkraft platform, der er lettere at forstå gennem visuel repræsentation snarere end tekst alene. Til fotopolymerisering af basishydrgelen skal der først tilsættes tre mikroliter af præpolymeropløsningen på et tyndt, fladt ark perfluoroalkoxy-alkalner, og der skal være flade 150 mikrometer tykke PDMS-strimler omkring, men ikke i kontakt med dråben af præpolymeropløsning. Placer en acrylat silanized coverslip på PDMS, med pre-polymer dråbe centreret under coverslip at flade pre-polymer dråbe til tykkelsen af PDMS afstandsløbere.
Udsæt den klemt præ polymeropløsning til UV-lys i ca. et minut. Når en hydrogel er fuldt dannet, skal du forsigtigt adskille dækslæbet fra PDMS afstandsklip. Brug højtydende dobbeltsidet akryllim til at fastgøre en åben bund petriskål til dækslæbet.
Vær særlig forsigtig, når du klæber den hydrogel-belæssede coverslip til Petriskålen. En våd skål eller for lidt tryk under påføring vil tillade lækager til at danne, ødelægger prøven. Tryk på den klæbende kontaktflade for at skabe en komplet tætning mellem dækslæbet, limen og petriskålen, idet du skal passe på ikke at knække glasset.
Brug sterilt filtreret PBS til at skylle hydrogelen. Derefter tilsættes otte mikroliter NVP til 800 mikroliter af laboratorieopløsningen, der er forberedt til hydrogelsyntesen. Hvis du vil konvertere et binært billede til en digital maske, skal du åbne MATLAB og åbne og køre løbesescriptet.
m MATLAB-script. Vælg den binære TIF-fil til konvertering, og vælg en mappe for at gemme områdets filer. Indtast den ønskede endelige størrelse i mikron af det valgte billede.
Inputbilledet skaleres og dimensioneres, så det svarer til disse parametre. Hvis du vil oprette en enkelt pixelmatrix, skal du fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet Fjern tic under Små områder/enkelte pixel i indstillinger for interessegenerator, markere afkrydsningsfeltet Firkanter og fjerne markeringen i Brug under Vandrette brydlinjer. Klik derefter på OK. OVL-filen findes i den tidligere angivne mappe.
Åbn filen i mikroskopsoftwaren, og indlæs de ønskede områder, der styrede laserdodderen under to fotonlaserscannings litografi. Følgende trin bør udføres under forhold med minimalt lys. Til fremstilling af fiducial markør arrays under svagt lys betingelser, grundigt blande 200 mikroliter af den tidligere forberedte NVP lab løsning med 20 milligram Alexa Fluor 633 og fjerne alle PBS fra skålen indeholder hydrogel.
Peg-633-blandingen til hydrogelen som en dråbe, der helt omfatter basishydrgelen, og petriskålen læsses på prøveholderen på mikroskopstadiet. Derefter dække fadet og lad mønsteropløsningen suge ind i hydrogel i mindst 30 minutter, beskyttet mod lys. Hvis du vil konfigurere mikroskopet til billedbehandling, skal du vælge de relevante lasere og filtre til visualisering af Alexa Fluor 488.
Hydrogelen skal lokaliseres ved hjælp af PEG-488-signalet, og indkreds samlingen af længere emissionsbølgelængder fra detektoren. Brug lodrette og vandrette feltscanninger til at finde midten af hydrogelen i XY-planet og nul trin i denne position. Brug linjescanninger i Z-stack-funktionen til at finde hydrogelens overflade og nulfokus i denne position.
Niveau hydrogel ved at gentage linjen scanninger væk fra XY center for at identificere overfladepositionen, justere de indstillede skruer til mikroskop fase, efter behov. I mikroscope-softwarearbejdsområdet skal du oprette en separat eksperimentfil til fotopattering og indstille multifoton-strømmen til 1,8 % og scanningshastigheden til seks. Juster størrelsen på billedrammen og pixel for at opnå en pixelstørrelse på 0,1 mikrometer pr. pixel og et højde-bredde-forhold på 100 til et, og indlæs områdefilen i områdets fane.
Brug en makro til at indstille alle de områder, der skal hentes og aktiveres. Afstand skal indstilles til 3,5 mikrometer for en samlet dybde på 28 mikrometer og det samlede antal Z-skiver på ni. Brug derefter funktionen Positioner til at angive bestemte steder på hydrogelen, hvor de fiduciale markørarrays vil blive fotopatterned.
Som suge tid nærmer sig 30 minutter mærket, erhverve successive Z-stack linje scanninger af overfladen af hydrogel hvert femte minut for at kontrollere for hævelse baseret på ændringer i placeringen af overfladen i forhold til nulstillet fokus position. Hvis der ikke er sket nogen ændring i overfladepositionen i løbet af intervallet på fem minutter, skal du køre mønsterindstillingerne og bruge 488 nanometerlaseren til at kontrollere, at hydrogelens overflade ikke bevægede sig under mønsteret. Fjern derefter hydrogelen fra mikroskopet, aspirere PEG-633-opløsningen fra petriskålen, og skyl skålen med sterilt filtreret PBS.
Hvis du vil anskaffe en celle- og fiducial markørbilleder, skal petriskålen returneres til prøveholderen for at finde de mønstrede områder. Find en celle af interesse og erhverve en overført eller fluorescerende billede af cellen. Anskjære derefter en Z-stack af den mønstrede matrix under cellen som påvist, og erhverve et andet sæt transmitterede eller fluorescerende billeder af cellen.
Når du indsamler en billedstak, skal de resulterende billeder vise en regelmæssig vifte af mønstrede funktioner, der svinger i intensitet som en funktion af Z-positionen i billedstakken. Sporingen. m script giver flere diagnostiske billeder, herunder en Z-projektion af fluorescerende fiducial markører til at vurdere den præ-behandling kvalitet, et plot af de fundne centroider, farvekodet som en funktion af Z position til at vurdere objektet afsløring kvalitet, og et plot af de spor, der repræsenterer de fundne markør centroids, der er blevet knyttet til kolonner i Z retning til at vurdere objektet tracking kvalitet.
DISP 3D.m-scriptet giver et billede af intensitet som en funktion af Z-positionen for hver kolonne af fundne funktioner i en given billedstak for at vurdere kvaliteten af de fiduciale markørintensitetsprofiler. Begge DISP 3D.
m og DISP-forskydning. m sammen giver histogrammer af den målte forskydningsstøj i hver af de kartesiske koordinatdimensioner samt interpolerede varmekort over forskydning. Desuden er interp final3D_2.
m giver varme kort over overfladen trækkraft beregnet ved hjælp af outsourcet kode. Det vigtigste at huske under denne procedure er, at opløsninger, der indeholder LAP, er følsomme over for lys og bør beskyttes så meget som muligt mod omgivende lyskilder. Husk, at NVP er en flygtig organisk forbindelse og altid skal håndteres i en kemisk flowhætte.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
