Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Måle effekten av bakterier og kjemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans
Chapters
Summary December 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver hvordan du kan måle intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denne metoden er nyttig for grunnleggende biologisk forskning på intestinal helse relatert til samspillet mellom tarmbakterier og deres vert og for screening for å identifisere probiotiske og kjemiske agenter for å kurere leaky gut syndrom og inflammatoriske tarm sykdommer.
Transcript
Denne metoden vil være nyttig for grunnleggende biologiske studier knyttet til samspillet mellom tarmmikrobiota og tarmhelse. I tillegg kan denne protokollen brukes til screening av potensielle probiotika og nutraceuticals for å kurere tarmhelseproblemer, som lekkasje tarmsyndrom og inflammatoriske tarmsykdommer. Denne protokollen bruker et bildesystem med høy gjennomstrømning for å muliggjøre rask og presis kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet i C.elegans behandlet med ulike bakterier og kjemikalier.
Vi anbefaler at en forsker som ikke er kjent med denne teknikken begrenser antall prøver for å unngå feilmerking og andre feil. Denne prosedyren består av mange trinn som krever visuell demonstrasjon, for eksempel overføring av ormer til 96-brønnsplater og bruk av Operetta-maskinen, samt Harmony-programvaren. Start med å forberede 500 milliliter sterilt LB medium.
Inokuler en enkelt koloni av P.aeruginosa inn i mediet, og inkuber kulturen i 14 til 15 timer ved 37 grader Celsius mens du rister på 150 rpm. Neste dag, jevnt fordele bakteriekulturen i to 500-milliliter rør, og sentrifuge dem på 3, 220 ganger g og fire grader Celsius i 30 minutter. Fjern supernatant, la 25 milliliter i hvert rør, for et totalt gjenværende volum på 50 milliliter, og deretter gjenbruke bakteriell pellet.
Oppbevar bakteriekulturen ved fire grader Celsius til den er klar til bruk. For å teste effekten av bakterier på intestinal permeabilitet av C.elegans, fjern kulturene fra kjøleskapet og virvle dem grundig. Tilsett totalt 800 mikroliter til hver friske NGM-plate, og la platene tørke i en 20-graders Celsius inkubator over natten.
For å forberede DIM-plater, tilsett 50 ml NGM agarmedium i en flaske DIM som inneholder NGM kjøttkraft, og bland godt. Hell deretter 20 milliliter av mediet i hver 90-by-15-millimeter Petri-skål. Forbered DMSO-platene ved å tilsette 20 milliliter DMSO som inneholder NGM medium til hver petriskål, og la platene stå ved romtemperatur i minst tre timer for å stivne.
Spre 800 mikroliter vortexed E.coli eller P.aeruginosa kultur på hver friske NGM plate, og la platene tørke i en 20-graders Celsius inkubator over natten. Vask de alderss synkroniserte L4 larver med S-buffer, og overfør ca 500 ormer til NGM plater som inneholder forskjellige bakterier og kjemikalier. Deretter inkubere platene ved 20 grader Celsius i 48 timer.
Forbered FITC-dextran-supplerte plater ved å blande to milliliter varmeaktivert E.coli med fire milligram FITC-dextran. Tilsett 100 mikroliter av blandingen til hver av 20 ferske NGM agarplater, og la platene tørke i en time på en ren laboratoriebenk. Etter 48 timers behandling vasker du ormene med S-buffer, overfører dem til FITC-dextran-supplerte plater og til NGM-plater uten FITC-dextran, og inkubere platene over natten.
Neste dag, vask ormene med S-buffer, og la dem krype i den friske NGM agarplaten i en time. Tilsett 50 mikroliter med 4% formaldehyd til hver brønn av en svart, 96-brønn, flatbunnet plate, og overfør ca 50 ormer til hver brønn. Etter ett til to minutter, fjern alle formaldehyd, og legg til 100 mikroliter monteringsmedium i hver brønn.
Formaldehyd er et giftig kjemikalie og bør håndteres med forsiktighet. Hvis du vil ta bilder fra fluorescerende, trykker du på Åpne lokk-ikonet i bildebehandlingsprogramvaren og setter platen inn i maskinen. Klikk Oppsett, velg platetypen, og legg til brightfield- og EGFP-kanalene.
Hvis du vil justere oppsettet, går du til Oppsett-valget og velger Spor. Sett det første bildet på ett mikrometer, antall fly til 10, og avstanden til ett mikrometer. Velg en av behandlingsbrønnene og ett fangstfelt, og trykk Test i Kjør eksperiment-delen.
Hvis bildene er tilfredsstillende, går du tilbake til Oppsett-delen og trykker på Tilbakestill-ikonet. Deretter velger du alle målbrønnene og et passende antall fangstfelt. Gå til Kjør eksperiment, skriv inn platenavnet, og trykk Start.
For å måle fluorescensintensiteten, gå til Bildeanalyse-delen, skriv inn bildet og finn cellen ved å velge EGFP-kanalen og metoden B.Juster parametrene i henhold til manuskriptinstruksjonene, og velg gjennomsnittet som utgang. Trykk på Bruk-ikonet for å lagre oppsettet. Få et varmekart og en datatabell ved å gå til Evaluering-delen og justere avlesningsparameteren, og start deretter evalueringen.
C.elegans viste en betydelig økning i FITC-dextran fluorescens etter inkubasjon med P.aeruginosa sammenlignet med de to andre bakterielle stammene, noe som indikerer at P.aeruginosa forårsaket mer vital skade på epiteltt gut barrieren og økt intestinal permeabilitet. Levende og varmeinaktivert P.aeruginosa utløste svært forskjellige effekter på tarmpermeabiliteten i C.elegans. Ved varmeinaktivering indikerer både fluorescensbildene og statistiske data at P.aeruginosa ikke utløste noen toksisitet for nematoder.
En 48-timers samtidig behandling med DIM reduserte SIGNIFIKANT FITC-dextran fluorescensintensiteten inne i tarmene til ormer utsatt for P.aeruginosa, noe som viser at DIM kan betraktes som et godt naturlig produkt for å kurere intestinal permeabilitetsdysfunksjon forårsaket av bakterielle infeksjoner. Det er viktig å huske at under fremstillingen av FITC-dextranbelagte plater må du minimere lyseksponeringen på grunn av lysfølsomheten til FITC-dextran. Denne teknikken kan brukes til å bestemme de patogene og probiotiske effektene av tarmbakterier og deres aktive komponenter ved å teste bakteriene, samt deres kjemiske sammensetning.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
