Biochemistry
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用于大规模核相互作用分析的无标签免疫沉淀质谱工作流程
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描述是一种蛋白质组学工作流程，用于利用感兴趣的特定蛋白质和无标签质谱的免疫亲和力来识别来自核亚细胞部分的蛋白质相互作用伙伴。该工作流程包括亚细胞分馏、免疫沉淀、过滤器辅助样品制备、离线清理、质谱和下游生物信息学管道。
Transcript
这种蛋白质组学工作流程能够无偏地识别和映射内源蛋白蛋白与亚细胞分辨率的相互作用。当研究剂量敏感、丰度低或具有多个亚细胞定位的诱饵蛋白时，这种技术特别有利。这种方法可以应用于映射内源蛋白相互作用假设有一个合适的亲和力试剂可用。
这对于数千种功能不明的蛋白质来说尤其重要，其中许多蛋白质都与人类疾病有关。此方法可适用于任何细胞系或可适应亚细胞分馏的组织。任何具有适当亲和试剂的蛋白质都可能是靶向的。
亲和力纯化实验的常见结果通常不是结果。真正好的试剂、收集整个的质量控制数据以及限制样品处理都非常重要。知道你有一个样本。
首先，用蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂将准备好的细胞颗粒在1X颗粒体积的冷缓冲A中解冻15分钟。将含有细胞颗粒的管子在摄氏4度的螺母上，以帮助重新呼吸30分钟。然后将管子放在离心机中，温度为2000倍，4摄氏度，10分钟进行颗粒。
去干上流剂，用缓冲液 A.在冰上孵育20分钟，用5倍的包装细胞体积重新暂停。接下来，在2000倍的g和4摄氏度的颗粒下再次颗粒10分钟。使用2倍原包装的细胞体积缓冲液A与蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，释放缓冲液和再增。
在2000倍的g和4摄氏度下，用松动的害虫 A. 将酸盐离心10分钟。小心地将上清液转移到新管中，用液氮将其闪冻。将酸盐储存在零下80摄氏度。
用蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂将颗粒与0.9倍的缓冲B颗粒体积重新吸收，并在4摄氏度下在坚果上混合5分钟。为了将核化，用滴答声B.在4摄氏度下将核酸盐混合在螺母上30分钟，使其均匀。然后在4摄氏度下将核酸盐以21000倍g离心30分钟。
从上清液中移掉，保存为可溶性核蛋白提取物。要透析可溶性核提取物，首先用8千达顿分子量切口切割适当长度为24毫米宽的透析管。夹紧管子的一侧，将核质加载到管子中。
装载莱酸盐后，夹紧另一端，并潜入含有蛋白酶抑制剂缓冲器C的清洁玻璃容器中。在摄氏四度下，迪亚里兹三小时。之后，将透析的核子核酶转移到管中，在4摄氏度下以21000次g离心，30分钟。
将核提取物的三个20微升等分条转移到新的微离心管中，由西方印迹进行分馏验证。使用在尖端切开的移液器尖端，在微离心管中将12.5微升珠量的蛋白质 A Sepharose 与 12.5 微升的蛋白质 G Sepharose 相结合，为每次复制准备蛋白质 A/G 珠混合物。用300微升的IP缓冲液将珠子在4摄氏度下以1，500倍g旋转，洗涤两次，然后将缓冲液倒入一分钟。
接下来，准备抗体蛋白 A/G 珠子。要将抗体与珠子结合，请加入300微升的IP缓冲液 I和10微克所需的抗体。让珠抗体混合物在四摄氏度的高温下在坚果上摇动。
现在，将适当的核酸盐体积分成低保留微离心管，每次复制一毫克蛋白质输入。旋转裂酸在16，000次g30分钟，并转移上一根到一个新的管。每毫克核酸盐以每微升250单位添加一微升，在4摄氏度的坚果上用岩石，在10至15分钟内加入。
要准备珠子预清除酸盐，将每种蛋白质 A 和蛋白 G 珠的 12.5 微升添加到 1.5 毫升低保留管中。用IP洗涤缓冲液我用蛋白酶抑制剂洗两次。去缓冲液，在珠子上加入一毫克准备好的核酸盐。
在摄氏四度下在螺母上摇动一小时时孵育。将预清除的 lysate 在 1，500 倍 g 和 4 摄氏度下离心一分钟。然后用IP缓冲液 I 用蛋白酶抑制剂洗两次抗体蛋白 A 或 G 珠子。
在 1，500 倍 g 和 4 摄氏度下离心一分钟后，将缓冲液去掉。现在将预清除的核利酸盐转移到抗体蛋白 A 或 G 珠子上。在摄氏四度下摇动螺母时孵育四小时。
孵育后，在1500倍g和4摄氏度的离心机1分钟。将上经器转移到标记为每个复制的流中的管中。用蛋白酶抑制剂用一毫升IP缓冲液II洗四次抗体蛋白 A 或 G 珠子。
然后用一毫升的IP缓冲液 I 用蛋白酶抑制剂洗两次珠子。确保上次洗涤后拆下所有缓冲液。在坚果上用20微升0.1摩尔甘氨酸在pH 2.75下孵育，将蛋白质从珠子上分离掉，每次30分钟。
然后在750倍的g和4摄氏度旋转一分钟，并移液器关闭上流水。再次使用洗脱缓冲器重复此孵育。制备蛋白颗粒后，用30微升SDS烷基化缓冲液重新暂停。
在95摄氏度的热块上孵育样品5分钟。然后在室温下冷却15分钟。在每个样品中加入300毫升的 UA 溶液和 30 微升 100 毫摩尔 TCEP。
将溶液加载到 30K 离心过滤器上。在室温下以 21，000 次 g 旋转离心过滤器 10 分钟后，保持流量通过，以防过滤器出现问题。根据手稿清洗过滤器后，添加三微升，每微升一微克，在 0.1 摩尔三微 pH 8.5 中重新发送。
用 0.1 摩尔三叶（pH）8.5 填充高达 100 微升标记的滤光片。在37摄氏度下，在摇坚果时，允许它消化一小时。接下来，添加一微升一微克每微升MS级 trypsin。
轻轻混合，让三辛在37摄氏度下与样品一起孵育，同时在螺母上摇动。早晨，在21，000次g下多次离心机，20分钟，将过滤器中的肽过滤成一个干净的低保持微离心管。使用C18旋转柱脱盐肽后，在7微升中重新暂停冻干肽，其中0.1%TFA为5%。。
对样品进行三分钟的声波化，以确保多肽被重新暂停，然后以14，000次g旋转10分钟。将样品的15%至30%加载到液相色谱质谱系统中进行分析。在这项研究中，利用仅珠子控制，从5毫克的 HeLa 核提取物中分析了三钙免疫沉淀。
诱饵DYRK1A在控制上名列前三名，表明所执行的IP-MS实验是可靠的。高置信度相互作用者之间有明显的分离，超过95%的共纯蛋白被确定为非特异性蛋白质。对于 DYRK1A 数据集示例，IREF 交互伙伴显示的 FC-A 值低至 0.45，表示对控制的扩充非常低。
因此，这些以前报告的交互中，有许多是低于 FC-A 阈值 3 的误报。每个 IREF 交互的计算绝对拷贝数与 IP-MS 的交互伙伴的检测级别没有相关性。FC-A大于3和圣人大于0.9的组合使用将高置信度相互作用者列表减少到6种蛋白质。
然而，当单独应用大于三个的FC-A截止时，网络中又添加了八种蛋白质。该协议最关键的部分是选择用于免疫沉淀的抗体试剂。在完成此工作流程之前，建议对选择性进行西式印迹或库马西验证。
蛋白质-蛋白质相互作用的辅助证据可以从识别的相互作用器的共IP西方印迹获得。蛋白质化学交错虽然比较复杂，但可以揭示相互作用者的互动域。利用这种方法，我的研究小组发现了DYRK1A的新功能，DYRK1A是哺乳动物大脑发育所需的蛋白质激酶，与阿尔茨海默氏症神经病理学有关。
Tags
生物化学， 问题 153， 质谱， 蛋白质组学， 亚细胞分馏， 免疫沉淀， 相互作用， 生物信息学， 工作流程Related Videos
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