Biochemistry
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सिंगल-सेल ड्रग तेज, मेटाबोलिज्म और इफेक्ट्स का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफॉर्म
Chapters
Summary January 9th, 2020
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यह प्रोटोकॉल एक एकीकृत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मंच प्रस्तुत करता है जो एकल-सेल संकल्प प्राप्त करने में सक्षम है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि एमएस का उपयोग दवा तेज और चयापचय के लक्षित और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Transcript
हमने मेटाबोलोमिक्स के लिए एक अभिनव विधि विकसित की है। हमने जीवित कोशिकाओं के बेलफ्राई स्पेक्ट्रल इमेजिंग को एकल-कोशिका द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त किया। हमारी तकनीक दवाओं के खिलाफ एकल कोशिकाओं के मेटाबोलिक परिवर्तनों की निगरानी और भविष्यवाणी कर सकती है।
और यह मूल बातें अनुसंधान और उद्योग के लिए आवेदन का एक बहुत खुलता है। हमारी विधि वर्तमान दवा मूल्यांकन तकनीकों के लिए एकल-सेल संकल्प जोड़ती है जो भविष्य की दवा खोज प्रयासों में बहुत सहायता करेगी। हमारी तकनीक भी हमें कैंसर प्रतिरोध में सेलुलर विषमता द्वारा निभाई भूमिका को समझने में मदद कर सकते हैं ।
इस प्रयोग में सिंगल सेल सैंपलिंग और डेटा एनालिसिस सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू हैं । फिलहाल हम इन दोनों स्टेप्स को ऑटोमेशन करने पर काम कर रहे हैं, खासकर सैंपलिंग पार्ट । हम आपको प्रयोग से पहले एकल-सेल नमूने का अभ्यास करने की सलाह देते हैं, क्योंकि प्रत्येक माइक्रोमैनीपुलेटर सेटअप थोड़ा अलग है और आपको नियंत्रणों से परिचित होने के लिए समय लेना चाहिए।
कोशिकाओं को 70% तक पहुंचने के बाद, एक उपयुक्त संस्कृति मीडिया में रुचि की संस्कृति कोशिकाएं, संदूषण से बचने के लिए पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें। एक हीमोसाइटोमीटर पर सेल घनत्व को मापने के बाद, उपसंस्कृति कोशिकाओं को 35 मिलीमीटर ग्लास बॉटम ग्रिड डिश या क्वार्ट्ज स्लाइड में, छठे से 0.7 गुना 10 के सीडिंग घनत्व पर एक ही माध्यम का उपयोग करके। फिर 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
अगले दिन, कोशिकाओं को ५० से ६०% की एक उदारता तक पहुंचने के पूर्व गर्म PBS बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने ३७ डिग्री सेल्सियस पर । कोशिकाओं को 35 मिलीमीटर संस्कृति व्यंजनों में दवा उपचारित और अनुपचारित उपसमूहों में विभाजित करें। दो मिलीलीटर और 10 माइक्रोमोलर की टैमोक्सिफेन एकाग्रता की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए संस्कृति मीडिया के साथ डिमेथिल सल्फोक्साइड में भंग टैमोक्सिफेन मिलाएं।
यह दवा का इलाज समूह है। DMSO के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक नियंत्रण समूह के रूप में माध्यम में DMSO की एक इसी मात्रा मिलाएं। स्पेक्ट्रल मापन से पहले 70 से 80% की एक लहर तक पहुंचने के लिए नुकीला मीडिया के दो मिलीलीटर में दोनों समूहों को इनक्यूबेट करें, एक लक्ष्य का उपयोग करके पिनहोल और लेजर स्थिति मैच को सत्यापित करें।
प्रत्येक प्रयोग से पहले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को कैलिब्रेट करने के लिए, एक ग्लास बॉटम डिश में इथेनॉल रखें, एक सेकंड के लिए दिए गए लेजर तीव्रता पर स्पेक्ट्रम को मापें, और चोटी को ज्ञात तरंगदैर्ध्य में संबद्ध करें। इसके बाद माइक्रो चैंबर को 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेटअप करें। एक बार माइक्रोस्कोप सिस्टम तैयार हो जाने के बाद, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटा दें और तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पीबीएस बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को कुल्ला करें।
फिर गर्म पीबीएस या फ्लोरोब्रिटे डीएमईएम के दो मिलीलीटर जोड़ें। जल विसर्जन उद्देश्य लेंस पर पानी के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। और नाजुक माइक्रोस्कोप चरण पर कांच के नीचे सेल पकवान जगह है।
रमन माइक्रोस्कोप पर सेल सैंपलिंग सिस्टम को ठीक करें। 3डी माइक्रोमैनिपुलेटर को ग्लास केशिका धारक से कनेक्ट करें जो नमूना चूसने के लिए एक खाली सिरिंज से जुड़ा हुआ है। कांच के केशिका की नोक का निरीक्षण करने के लिए माइक्रोस्कोप को 40 बार के उच्च आवर्धन क्षेत्र में सेट करें, और सुनिश्चित करें कि यह टूटा हुआ नहीं है।
माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके ग्लास केशिका की स्थिति को नियंत्रित करें। सुनिश्चित करें कि केशिका टिप देखने के क्षेत्र में केंद्रित है। फिर बाद में कल्चर डिश के लिए क्लीयरेंस देने के लिए केशिका को जेड-एक्सिस पर ले जाएं ।
नमूना पकवान को माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें, आवर्धन और ध्यान को समायोजित करें, ग्रिड डिश पर लक्ष्य सेल का चयन करें, और इसे देखने के केंद्र में ले जाएं। लेजर लाइन को फोकस करके प्रत्येक सेल को मापें। एक स्पष्ट रमन संकेत के साथ एक सेल के एक क्रॉस सेक्शन प्राप्त करने के लिए प्रति सेल एक 15 सेकंड एक्सपोजर समय पर्याप्त है ।
एक गैल्वानो-मिरर कई दर्जन मिनट के भीतर एक कोशिका या कोशिकाओं के समूह की स्कैनिंग की अनुमति देता है। फिर ध्यान से माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग कर ग्लास केशिका नीचे कम जब तक टिप ध्यान में आता है । सूक्ष्म अवलोकन के तहत, केशिका टिप के साथ लक्ष्य एकल कोशिका को स्पर्श करें।
फिर केशिका टिप के अंदर सेल को ट्रैप करने के लिए सिरिंज का उपयोग करके नकारात्मक दबाव लागू करना शुरू करें। सेल के समय और चूसा स्थान की जांच करने के लिए एक वीडियो लेकर इस प्रक्रिया को रिकॉर्ड करें। केशिका को जेड-एक्सिस पर ले जाएं।
फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की तैयारी में संदंश का उपयोग करके केशिका धारक से केशिका को अलग करें। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंट स्थापित करने और मीडिया का विश्लेषण करने के बाद, सेल युक्त केशिका में आयनीकरण विलायक के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। एक उपयुक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े नैनो-इलेक्ट्रोस्प्रे एडाप्टर के लिए केशिका को ठीक करें और स्वचालित अधिग्रहण विधि शुरू करें।
प्रत्येक स्थिति के औसत स्पेक्ट्रम का तुलनात्मक विश्लेषण, दवा उपचार के साथ और बिना, यहां दिखाया गया है। दोनों स्थितियों का औसत स्पेक्ट्रम विभिन्न चोटियों पर स्पष्ट रूप से भिन्न होता है। विशेष रूप से, चोटियों पर 1, 000 प्रति सेंटीमीटर, जो फेनिलैनिन और टायरोसिन जैसे सुगंधित यौगिकों के लिए एक संकेत है, मजबूत अंतर दिखाते हैं।
अव्यक्त संरचना मॉडल पर प्रक्षेपण के आधार पर, वीआईपी स्कोर की गणना की गई थी जो प्रायोगिक स्थितियों के साथ भेदभाव करने में तरंगदैर्ध्य के महत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं । महत्वपूर्ण बात यह है कि वीआईपी प्रोफाइल की सबसे ऊंची चोटियों ने रमन चोटियों के अनुरूप किया जिसके लिए दोनों उपचारों के बीच मजबूत मतभेद देखे गए । यह इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं के बीच विशिष्ट आणविक मतभेदों की पुष्टि की ।
सकारात्मक पहचान के बाद, दवा और उसके मेटाबोलाइट्स की सापेक्ष बहुतायत प्रत्येक कोशिका में मापा गया था और अनुपचारित कोशिकाओं में पृष्ठभूमि चोटियों की तुलना में। टैमोक्सिफेन बहुतायत में मजबूत भिन्नता देखी गई। और इस घटना को इसके मेटाबोलाइट 4-हाइड्रोक्सी-टैमोक्सिफेन के मामले में और भी स्पष्ट किया गया था।
शोधकर्ताओं ने स्पेक्ट्रल छवियों और कोशिकाओं के मेटाबोलिक प्रोफाइल के बीच की कड़ी की खोज में रुचि हो सकती है । हमारे शोध में औद्योगिक अनुप्रयोग भी हैं क्योंकि यह दवा निर्माण के लिए कोशिकाओं की स्थानीय स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर माप के लिए आयनीकरण सॉल्वेंट तैयार करते समय देखभाल की जानी चाहिए।
इसे धूम हुड के नीचे तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बिजली से बचने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर उपकरण के आयन स्रोत को छूने के लिए नहीं सावधान रहें। अंत में, माप भर में उपयोग की जाने वाली नमूना केशिकाएं बहुत तेज होती हैं, इसलिए चोट से बचने के लिए उन्हें देखभाल के साथ संभालें।
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