Cancer Research
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पारगम्य झिल्ली समर्थन के साथ सह संस्कृति का उपयोग कर मैक्रोफेज सक्रियण पर ट्यूमर स्रावित पैराक्रिन लिगांड्स के प्रभाव का अध्ययन
Chapters
Summary November 28th, 2019
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यहां, हम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले गैर-संपर्क पैराक्रिन सिग्नलिंग के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए पारगम्य झिल्ली का उपयोग करके एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह प्रणाली मैक्रोफेज सक्रियण को गीला करने में ट्यूमर-स्रावित कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है।
Transcript
इस ट्रांसवेल सह-संस्कृति विधि का उपयोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले पैराक्राइन सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इस विधि का उपयोग उपन्यास स्रावित लिगांड की खोज के साथ-साथ उनके प्रतिरक्षा दमनकारी प्रभावों के मशीनी आधार को खोजने के लिए किया जा सकता है। हमने पहले इस विधि का उपयोग यह दिखाने के लिए किया है कि ट्यूमर-स्रावित कारक मैक्रोफेज प्रो-भड़काऊ जीन ट्रांसक्रिप्शन को कैसे गीला कर सकते हैं।
हमारा मानना है कि इस उपकरण ट्यूमर व्युत्पन्न प्रतिरक्षा दमन के अध्ययन में व्यापक निहितार्थ है । इस तकनीक के मुख्य फायदों में से एक यह है कि इसका उपयोग कोशिका-से-सेल संपर्क के संभावित भ्रामक चर के बिना ट्यूमर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच पैराक्रिन सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह मंच डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार की आणविक जैविक तकनीकों के लिए भी उत्तरदायी है।
पेरिटोनियल मैक्रोफेज की कटाई के बाद, उन्हें सीधे 0.4 माइक्रोमीटर पॉलिएस्टर झिल्ली के ऊपरी कक्षों में प्लेट करें सह-संस्कृति छह-अच्छी प्लेट डालें। फिर अच्छी तरह से पूरक डीएमईएम जोड़ा गया कि शीर्ष कक्ष में एक मिलीलीटर होता है और नीचे के कक्ष में 1.5 मिलीलीटर होते हैं। तीन दिनों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
सबसे पहले, संस्कृति अपने संबंधित माध्यम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्यूमर कोशिकाओं, एटीसीसी के बाद ऊतक संस्कृति के तरीकों की सिफारिश की । इसके बाद, पीबीएस के साथ एक बार अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं को धोएं। EDTA में 0.05% ट्राइप्सिन जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
फिर एफबीएस युक्त मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। गोली के लिए पांच मिनट के लिए २२० बार जी पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र की कुल संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर का उपयोग करें । अपकेंद्रित्र के दौरान, पारगम्य झिल्ली समर्थन प्लेटों वाले मैक्रोफेज के ऊपरी और निचले कक्षों से माध्यम को एस्पिरेट करें और ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
निचले कक्षों के लिए जहां ट्यूमर कोशिकाओं को चढ़ाया जाएगा, सेल इसके अलावा के लिए पर्याप्त मात्रा छोड़ने के लिए 1.5 मिलीलीटर के बजाय माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ भरें। जब अपकेंद्रित्र पूरा हो जाता है, तो गोली ट्यूमर कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें और 300, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर पूरक डीएमईएम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। वांछित कुओं के निचले कक्ष में इस सेल निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
मैक्रोफेज समर्थक भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, 50 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर और एलपीएस की एकाग्रता पर इंटरफेरॉन गामा को जोड़कर अकेले या सह-संस्कारी मैक्रोफेज का इलाज करें। आवश्यकतानुसार संस्कृति में उपचार के समय की अवधि भिन्न करें। मैक्रोफेज सक्रियण दो घंटे के भीतर होता है, और कुछ ट्यूमर-मध्यस्थता दमन आठ घंटे तक होता है।
24 घंटे के लिए सह संस्कृति मजबूत और लगातार ट्यूमर व्युत्पन्न दमन पैदावार । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, संस्कृति मैक्रोफेज अकेले और अनुपचारित छोड़ दें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, नमूनों के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही सांद्रता पर इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस के साथ अकेले-संस्कारी मैक्रोफेज का इलाज करें।
वांछित इनक्यूबेशन समय बीत जाने के बाद, परीक्षण की जरूरतों के आधार पर वांछित कोशिका lysate या शर्त संस्कृति माध्यम को अलग करें। मात्रात्मक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन एनालिसिस के लिए सेल lysate को अलग करने के लिए, कुएं के दोनों कक्षों से माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ एक बार धोएं। मैक्रोफेज वाले शीर्ष कक्ष में आरएनए लाइसिस बफर लागू करें।
इसके बाद, धीरे-धीरे झिल्ली को परिमार्जन करें ताकि सेल को जारी किया जा सके और आरएनए आइसोलेशन किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आगे के प्रसंस्करण के लिए इसे संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके। यहां वर्णित सह-संस्कृति विधि में शारीरिक संपर्क के बिना मैक्रोफेज और ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति शामिल है। ट्यूमर कोशिकाओं की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
पेरिटोनियल मैक्रोफेज B16F10 ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में सह-सुसंस्कृत लेकिन उत्तेजनाओं को सक्रिय किए बिना समर्थक भड़काऊ जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं करते हैं। इसका मतलब यह है कि ट्यूमर-स्रावित लिगामेंट्स या तो खुद से प्रो-भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, या यदि ट्यूमर स्राव द्वारा प्रतिरक्षा सक्रियण है, तो पैराक्राइन लिगांड इसे अपने मूल स्तर तक दबाने के लिए पर्याप्त हैं। यह सह-संस्कृति विधि दिखाती है कि जब इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस द्वारा ध्रुवीकृत मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत होते हैं, तो सूजन से जुड़े जीन अभिव्यक्ति के दमन को 60% से कम कर दिया गया था मैक्रोफेज प्रो-भड़काऊ जीन दमन का एक तुलनीय स्तर तब मनाया जाता है जब मुरीन मैक्रोफेज सेल लाइन J774 पेरिटोनियल मैक्रोफेज के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है।
पिछले काम एक ट्यूमर स्रावित कारक है कि मैक्रोफेज सक्रियण को बाधित कर सकते है के रूप में प्रोटीन एस की पहचान की है, तो पारम झिल्ली समर्थन सह संस्कृति मॉडल एक lysA के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है 24 घंटे के बाद वातानुकूलित मीडिया में प्रोटीन एस की एकाग्रता परख । इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस-इलाज B16F10 मेलानोमा कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया में, प्रोटीन एस लगभग 475 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता में व्यक्त किया जाता है। एक ही परिस्थितियों में इलाज पेरिटोनियल मैक्रोफेज ने लगभग 61 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पर प्रोटीन एस व्यक्त किया।
दिलचस्प बात यह है कि जब सह-संस्कारी, इंटरफेरॉन गामा और एलपीएस-इलाज में प्रोटीन एस की एकाग्रता लगभग 86 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर थी। इससे पता चलता है कि या तो मैक्रोफेज ट्यूमर-स्रावित प्रोटीन एस को निगलते हैं या कि मैक्रोफेज की उपस्थिति में B16F10 कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रोटीन एस की मात्रा में काफी कमी आई है। ये परिणाम मैक्रोफेज सक्रियण और पैराक्रिन सिग्नलिंग के गहन परिवर्तनों को उजागर करते हैं जब मैक्रोफेज ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी होते हैं।
ट्रांसवेल सह-संस्कृति विधि पैराक्राइन सिग्नलिंग से संबंधित कई तरह के सवालों के जवाब दे सकती है । पश्चिमी दाग विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए आयोजित किया जा सकता है कि कैसे ट्यूमर-स्रावित प्रोटीन मैक्रोफेज में विभिन्न सिग्नलिंग रास्तों को बदल देते हैं।
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